1. Préparation de sphéroïdes tumoraux 3D intégrés dans l’ECM
- Préparez un poste de travail avec les matériaux nécessaires à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
- Préparez un mélange dilué de sondes traceurs fluorescentes de 1 μm de diamètre modifiées au carboxylate en ajoutant 2 parties de sondes mères (2 % de solides) à 25 parties d’eau stérile.
- Sortez une bouteille de collagène bovin à 3,1 mg/ml du réfrigérateur et placez-la sur de la glace.
- Aliquote 125 μl de collagène dans un flacon vide de 2 ml.
- Ajoutez 50 μl de solution de sonde traceur diluée dans le flacon contenant le collagène et vortex brièvement pour répartir les sondes.
- Ajouter 235 μl de milieu de culture cellulaire approprié contenant du rouge de phénol (qui deviendra jaune) pour un volume total de 410 ml et agiter brièvement avant de prélever 205 ml (la moitié du volume total) et de le placer dans un nouveau flacon de 2 ml. Le flacon 1 contiendra le sphéroïde tumoral et le flacon 2 sera un mélange de contrôle.
- Ajouter ~2 μl de NaOH 1 M dans le flacon 1 pour ramener la solution à un pH neutre (le milieu de culture contenant du rouge de phénol doit redevenir rouge). Notez que cela fera que le mélange commencera à durcir s’il n’est pas conservé sur de la glace. Agitez brièvement pour mélanger, puis remettez immédiatement sur l’étagère à glace.
note: Le sphéroïde est à peine visible à l’œil nu après 9 jours de culture et son retrait du lit d’agarose est une tâche délicate. L’utilisation d’un microscope de dissection peut être utile pour certains utilisateurs. Le maintien de l’intégrité du sphéroïde pendant le transfert est primordial.
- À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, retirez délicatement 40 μl de milieu du puits contenant le sphéroïde tumoral. Conservez ces 40 μl pendant l’étape suivante.
- Vérifiez le puits pour voir si le sphéroïde a été retiré à l’étape précédente. Si c’est le cas, ajoutez les 40 μl contenant le sphéroïde dans le flacon 1. Si ce n’est pas le cas, remettez les 40 μl dans le puits et répétez l’étape précédente.
- Remuez doucement le flacon 1 (ne risquez pas de vortex, cela pourrait endommager le sphéroïde) avant de transférer le mélange en portions de 60 μl dans trois puits séparés d’une plaque de 96 puits. Inspectez chaque puits au microscope après avoir ajouté le mélange pour déterminer quel puits contient le sphéroïde.
- Ajouter ~2 μl de NaOH 1 M et 40 μl de milieu de culture cellulaire dans le flacon 2 et le vortex avant d’aliquote 60 μl de ce mélange dans un puits vide dans la plaque à 96 puits et l’étiquetage comme contrôle.
- Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pour durcir pendant au moins 1 heure.
2. Construire une grille de points d’échantillonnage et prendre une vidéo à chaque point
- Transférez la plaque d’échantillon de l’incubateur à la platine du microscope. Attendez 10 min pour que l’échantillon s’équilibre avec la température ambiante si une platine chauffée n’est pas disponible.
- Observez l’échantillon à l’aide d’objectifs de faible puissance pour vous assurer qu’il est intact et prêt pour l’imagerie. Déterminez la position de la tumeur dans le puits.
- Décidez du nombre de points d’échantillonnage à prendre. En règle générale, 20 points d’échantillonnage dans chaque puits, répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde, produiront des résultats suffisamment détaillés.
- Déplacez la platine dans la position souhaitée et utilisez un logiciel d’interface de microscope pour enregistrer les coordonnées x et y (ou enregistrez les coordonnées manuellement si le logiciel d’interface n’est pas disponible).
- Passez le microscope à un objectif haute puissance (généralement 100X) et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d’onde d’excitation des sondes de traçage. Utilisez la liste de points créée à l’étape 2.4 pour accéder au premier point de la grille.
- Ajustez la mise au point pour trouver le fond du puits, puis remontez pour trouver un champ de vision (FOV) contenant plusieurs sondes de traçage mises au point.
- Observez l’histogramme d’intensité et ajustez l’intensité et le temps d’exposition pour obtenir la plus grande plage dynamique possible tout en veillant à ce que l’image ne soit pas saturée.
- Obtenir une séquence vidéo à une fréquence d’images de 20 à 30 ms par image (environ 800 images ou 16 à 24 secondes sont recommandées pour fournir des statistiques suffisantes pour un calcul MSD robuste tout en tenant compte de la nécessité de réduire au minimum le temps d’acquisition à chaque point de la grille spatiale) et l’enregistrer avec une convention appropriée. Pendant l’enregistrement, ne touchez pas le microscope ou la table.
- Répétez les étapes 2.6 à 2.9 pour chaque point d’échantillonnage de la grille.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.10 pour chaque puits de l’expérience.
