Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Transduction de lignées cellulaires du cancer du pancréas
- Transduisez les cellules cancéreuses du pancréas pour exprimer la luciférase comme décrit précédemment. Les lignées cellulaires du cancer du pancréas Panc-1 et Capan-1 transduites avec la luciférase Firefly sont utilisées ici.
Remarque : La renilla luciférase ou la luciférase bactérienne peuvent également être utilisées.
2. Préparation des cellules cancéreuses du pancréas
- La culture a transduit les cellules cancéreuses du pancréas jusqu’à ce que 70 % soient confluentes.
- Liftez les cellules pancréatiques et assurez-vous que la viabilité est supérieure à 90 %.
- Remettre en suspension à 2 x 107 cellules/ml dans un mélange 3:2 de solution saline tamponnée Matrigel :Phosphate (PBS) réfrigérée.
- Conservez la suspension de cellules Matrigel sur de la glace avant l’injection dans le pancréas.
REMARQUE : Pour assurer une solidification rapide de Matrigel, réduisez le volume de PBS pour tenir compte du volume de la pastille de cellule. Manipulez Matrigel à l’aide d’instruments et de seringues glacés en tout temps pour éviter la solidification avant l’injection. Le numéro de cellule suggéré est un guide et doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée cellulaire.
3. Préparation de la souris
- Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane inhalé à 2-3 %. Déterminez la profondeur de l’anesthésie en fonction de l’absence de réflexe de la pédale ou d’un léger pincement des orteils.
- Appliquez du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation.
- Placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant à 37 °C et tournez doucement la souris pour soulever le côté gauche de l’abdomen.
- Préparez l’abdomen avec une solution de povidone iodée à 10 %.
REMARQUE : L’anesthésie injectable peut être utilisée à la place de l’anesthésie inhalée. Le jeûne préopératoire n’est pas nécessaire.
4. Laparotomie
- À l’aide d’instruments chirurgicaux stériles, faites une incision de 1,5 cm dans la peau à environ 1 cm à gauche de la ligne médiane.
- Faites une incision de 1,5 cm dans le muscle abdominal sous-jacent.
- Localisez la rate à l’aide de la pince et retirez délicatement la rate de la cavité abdominale. Fixez la rate le long d’un coton-tige stérile pour exposer le pancréas sous-jacent.
- Localisez la queue du pancréas adjacente à la rate.
- À l’aide d’une seringue à insuline de 29 g et 0,3 ml, injectez 20 μl de la suspension de cellules Matrigel dans le pancréas.
- Après l’injection, maintenez la seringue dans le pancréas pendant 30 à 60 secondes jusqu’à ce que le Matrigel se soit solidifié. Cette étape importante minimise les fuites de cellules.
- Inspectez le site d’injection pour vous assurer qu’il n’y a pas eu de fuite.
- Remettez la rate et le pancréas dans la cavité abdominale.
REMARQUE : Prenez soin d’éviter de percer la face dorsale du pancréas qui peut être mince.
5. Fermeture de la paroi abdominale
- Fermez la musculature abdominale de la souris avec une suture tressée 4-0 résorbable avec une aiguille ronde à l’aide d’un point continu.
- Fermez la peau externe avec une suture monofilament 6-0 non résorbable avec une aiguille coupante à l’aide d’un point continu.
- Retirer la souris de l’anesthésique inhalé et injecter 0,05 à 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.
- Laissez la souris récupérer dans sa cage posée sur un coussin chauffant à 37 °C avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Si les souris présentent des signes de douleur tels qu’une courbure ou une mobilité réduite, la buprénorphine peut être administrée toutes les 12 heures sur une période de 36 heures.
- Après la cicatrisation de la plaie (7 à 10 jours), anesthésez la souris et retirez les sutures externes.
6. Suivi bioluminescent de la progression du cancer du pancréas
- Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane inhalé.
- Injecter 150 mg/kg de D-luciférine par la veine de la queue.
- Placez la souris dans le système d’imagerie bioluminescente et capturez des images en lumière blanche et en bioluminescence.
- Retirez la souris de l’anesthésique inhalé et laissez-la récupérer dans sa cage d’origine.
REMARQUE : L’imagerie bioluminescente est non invasive et peut être effectuée périodiquement pour étudier la cinétique de croissance tumorale. Pour imager la tumeur de la queue pancréatique, il est important de placer la souris sur son côté gauche, de sorte que la tumeur pointe vers la caméra. Nous avons imagé une fois par semaine avec une fréquence augmentée jusqu’à trois fois par semaine avant le point final expérimental à l’aide d’un système d’imagerie Lumina II (Perkin-Elmer, anciennement Caliper Life Sciences) exécutant le logiciel Living Imaging 4.3.1 avec binning 4, FOV 12.5, F-stop 1, exposition 1 - 60 s (déterminée par l’exposition la plus élevée sans saturation en pixels).
