L'évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l'aide 31 P NMR Spectroscopy

Résumé

Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration avec ³¹ P spectroscopie RMN, combine les domaines de la biochimie et de la physiologie dans une expérience. Ce protocole permet la mesure dynamique de la teneur énergétique élevée en phosphate et chiffre d'affaires dans le coeur tout en même temps surveiller la fonction physiologique. Quand elle est réalisée correctement, il s'agit d'une technique précieuse dans l'évaluation de l'énergétique cardiaque.

Résumé

Modèles de souris transgéniques sont devenus des outils de recherche puissants à établir les relations de cause à effet entre les altérations moléculaires et des modèles de maladies cardio-vasculaires. Bien que la biologie moléculaire est nécessaire pour identifier les principaux changements dans la voie de signalisation, ce n'est pas un substitut pour signification fonctionnelle. Alors que la physiologie peut apporter des réponses à la question de la fonction, combinant la physiologie à l'évaluation biochimique de métabolites dans l'intacte, le cœur battant permet de brosser un tableau complet de la fonction cardiaque et de l'énergétique. Pendant des années, notre laboratoire a utilisé des perfusions cardiaques isolées combinées à résonance nucléaire (RMN) magnétique pour accomplir cette tâche. La fonction ventriculaire gauche est évaluée par la méthode de Langendorff mode de perfusions cardiaques isolés, alors que l'énergétique cardiaque est mesuré en effectuant

Protocole

1. Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément. Pour l'acquisition de ³¹ spectres P, un aimant Bruker 14T est interfacé avec la console Avance III et d'un ordinateur équipé du logiciel TopSpin V2.1. Pour l'évaluation de la fonction cardiaque, un système personnalisé construit perfusion cardiaque est interfacé avec le PowerLab 4/30 d'acquisition de données, équipé de la LabChartPro 6 du logiciel d'analyse de données.
2. Le jour de l'expérience, 1 litre de tampon Krebs-Henseleit est préparée comme suit: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm de KCl, 1,2 mm MgSO _4, 118mm NaCl, 25 mM NaHCO ₃ et. Le mélange est ensuite barboter avec 5% de CO _2/95% O ₂ pendant 10-15 minutes avant l'addition de 2 mM CaCl _2. Enfin, les substrats, sous la forme de 10 mM de glucose et 0,5 mM de pyruvate, sont ajoutés.
3. Régulation de la température lors de l'expérience est essentielle. Circulateurs chauffants sont utilisés pour maintenir la température entre 37,0 à 37,5 ° C tandis que le cœurest à l'intérieur de l'aimant. Température est surveillée pendant la durée de l'expérience en utilisant un capteur de température à fibre optique.
4. La pression de perfusion et de la pression ventriculaire gauche sont surveillés par des capteurs de pression reliés à un système d'acquisition de données et affichés à l'aide du logiciel inclus. Ceux-ci sont calibrés avec un sphygmomanomètre norme avant l'expérience. En outre, les conduites de pression sont vidées de manière adéquate afin d'éliminer toutes les bulles d'air.
5. Un échantillon standard de 150 mM de phosphate de sodium (qui est équivalent à la force ionique du tampon KH) est utilisé pour "calibrer" la sonde avant l'insertion du coeur. Ce qui facilite le signal diminue et le temps nécessaire pour commencer la période d'acquisition fois le coeur est positionné à l'intérieur de la sonde.
6. Pour réduire la coagulation, la souris reçoit une injection de 200 unités de l'héparine IP Après 5 minutes, du pentobarbital de sodium (175 mg / kg) IP est donnée.
7. Le cœur est rapidement excisé (avec les poumons d'und intacte thymus) et arrêté dans la glace froide tampon KH.
8. Bien conservés sur la glace, les poumons sont rapidement éliminés. Les lobes du thymus sont identifiés et délicatement décollée pour exposer l'aorte. Le thymus est supprimée. L'aorte est ensuite isolé en retirant avec précaution tout tissu environnant.
9. Micro pince de suture sont utilisés pour tenir doucement les deux parois de l'aorte à exposer le lumen. L'aorte est soigneusement placé sur la canule faite de 0,965 mm tubes en polyéthylène OD (PE50). L'aorte est maintenu en place avec une pince micro navire tandis que les sutures sont rapidement noué autour de l'aorte. La pince est retirée et les forceps sont utilisés pour contrôler soigneusement ce que la canule est au-dessus de la racine aortique. Liens supplémentaires sont ajoutés si nécessaire pour maintenir le cœur en place.
10. Tout tissu supplémentaire est retiré avec une pince et microciseaux. Une petite incision est faite dans l'oreillette gauche. Un tube de polyéthylène de 0,61 mm OD (PE10) est soigneusement inséré dans l'oreillette gauche, la cavité du VG, et à traversle sommet tout en douceur en maintenant le cœur. L'excès de tube est coupé.
11. Un dégonflé rempli d'eau ballonnet est inséré à travers l'oreillette dans le LV et est maintenu en place à l'aide de ruban adhésif ou des sutures. La vitesse de la pompe péristaltique est progressivement augmentée pour fournir un débit suffisant pour le coeur. Jusqu'à ce que le cœur est le lieu dans la sonde de la RMN, le cœur va continuer à être perfusé à débit constant équivalent à environ 2 ml / min. Le ballonnet est gonflé LV avec un petit volume à l'aide d'une seringue micromètre pour vérifier que le capteur de pression fonctionne LV.
12. Le cœur est soigneusement inséré dans un tube de RMN de 10 mm. Un large trou "spinner" est utilisé pour aider à orienter le tube dans la position correcte à l'intérieur de la sonde. L'ensemble du dispositif est alors solidaire de la "cordon ombilical" avec un ruban adhésif.
13. Le cordon ombilical est lentement abaissé dans l'alésage supérieur de l'aimant jusqu'à ce que le tube de coeur / RMN est à l'intérieur de la bobine de la sonde RMN 10 mm.
14. Une fois que l', ill'art est dans la bonne position à l'intérieur de la sonde, le débit de la pompe péristaltique est réglé pour obtenir une pression de perfusion de 80mmHg. (Rappelez-vous, que jusqu'à ce moment, le cœur a été perfusé avec un débit constant d'environ 2 ml / min). La pression de perfusion est alors maintenue en permettant le "hold" sur le mécanisme de commande de la pompe. Le coeur est alors d'un délai d'équilibration 15-20 minutes. Pendant ce temps, le volume du ballon LV est ajustée pour obtenir une pression en fin de diastole de 8-10 mmHg.
15. Au cours de la période d'équilibrage, il est nécessaire d'optimiser les paramètres du spectromètre afin d'obtenir le signal de phosphore meilleure possible. Ceci est accompli en mettant l'impulsion radio à la fréquence à laquelle le noyau de phosphore résonne ("tuning") et de rendre le champ magnétique homogène («calage»).
16. Après la période d'équilibrage, plusieurs spectres de RMN ³¹ P peut être obtenue. La période d'acquisition de chaque spectre est fonction de til intensité de champ de l'aimant, la taille de l'échantillon, et le rapport signal sur bruit requis pour un essai spécifique. Spectres sont obtenus à l'aide d'un aimant 14 Telsa par la moyenne du signal obtenu à partir de 256 impulsions à haute fréquence de 20 ms avec un angle de 60 degrés et les retards de bascules 2,0 secondes. Cette expérience aura besoin d'environ 10 minutes.

Les résultats représentatifs

Du matériel d'acquisition de données et le logiciel LabChart, plusieurs paramètres de la fonction cardiaque peut être mesuré à travers le protocole expérimental. La mesure de la fonction cardiaque typique, la pression développée ventriculaire gauche (LVDevP), est obtenue en soustrayant la pression en fin de diastole (PDE) de la pression systolique (figure 1). Cette mesure peut varier en fonction de la souche de la souris et l'état du cœur (par exemple, la surcharge de pression). Cependant, dans une normale C57BL6 LVDevP coeur de la souris est typiquement comprise entre 100-110 mmHg à taux fixe fin diastola pression publique de 8-10 mmHg. En outre, le programme permet LabChart pour la mesure de la fréquence cardiaque basée sur les mesures cycliques des ondes de pression LV. Encore une fois, cette mesure peut varier, mais les valeurs typiques sont de 350 à 400 bpm quand les cœurs sont autorisés à battre à taux intrinsèques. Cependant, le cœur peut être normalisée à l'aide d'un système de stimulation où la fréquence cardiaque est maintenue à 420 bpm. En outre, des mesures de contractilité (+ dP / dt) et de relaxation (-dP/dt) peut être estimée en utilisant la dérivée première de l'onde de pression LV. Pendant le protocole expérimental, il est facile de déterminer le mécanisme de Starling par incorporation d'une relation pression-volume. Ceci est accompli en faisant une augmentation graduelle du volume LV ballon et en notant la LVDevP ainsi que la PDE. Ces valeurs peuvent ensuite être tracées comme le montre la figure 2. Alors que la courbe de Starling est optimale, en notant le volume nécessaire pour atteindre une EDP de 8-10 mmHg peut donner une idée indirecte de LV chambre de dimension. Ceci peut être utilisé dans les modèles de bande aortiquetion que les coeurs hypertrophiés il faut généralement fournir un volume plus petit ballon en cœur dilaté besoin d'un plus grand volume par rapport aux témoins. Le tableau 1 présente des données représentatives de la fonction cardiaque comme acquis pendant le protocole de perfusion.

Le ³¹ P Spectromètre RMN qui fournissent des signaux de la phosphocréatine (PCr) et les trois phosphates de l'ATP (γ-ATP, ATP-α, β-et ATP), ainsi que le phosphate inorganique (Pi), comme illustré à la figure 2. Analyse de chacun de ces pics donne une valeur pour l'aire sous la courbe. La quantité d'ATP est estimé en calculant la moyenne de la γ-ATP et l'ATP-β zones. (L'α-ATP n'est pas utilisé parce que les molécules de NAD contribuer à une partie inconnue du signal total). Le statut énergétique du cœur est déterminée par le quotient de la PCr et les zones ATP (PCr: rapport ATP). Cette valeur est généralement de 1,5 à 1,7 dans un coeur de souris fourni avec le glucose comme substrat primaire. Bien RMN ³¹ P nefournir des mesures directes de l'ATP ou la PCR, l'aire des pics est proportionnelle à la quantité du phosphore contenant des composés dans l'échantillon. Les valeurs de ces signaux peuvent être estimés à l'aide d'autres méthodes. Par exemple, des mesures directes de l'ATP par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) dans une cohorte de cœur peuvent donner une concentration moyenne. Cette valeur peut alors être utilisé pour calibrer les surfaces moyennes ATP observées dans les spectres. La concentration PCR peut être calculé sur la base de la zone de PCr par rapport à la zone de l'ATP. Il est également possible d'estimer le pH en analysant le déplacement chimique relatif du phosphate inorganique (Pi) signal au signal PCr. ¹ Utilisation de différentes séquences d'impulsions radio, la vitesse de réaction de la créatine kinase ou la vitesse de réaction de synthèse d'ATP peut également être mesurée ^2.

Tableau 1. Base de la fonction cardiaque isolé perfusécœur. LVDevP: pression développée ventriculaire gauche; PTDVG: ventricule gauche en fin de diastole; HR: fréquence cardiaque; RPP: double produit; + dP / dt: dérivée première pression LV positive; -dP/dt: première pression négative dérivé LV; PP la pression de perfusion; CF:: débit coronarien.

Figure 1. Représentant ondes de pression LV de LabChart logiciel Pro.

Figure 2. Starling courbes représentatives de contrôle (trait plein) et l'aorte bandes (en pointillés) chez la souris. A) La fonction systolique représenté par LVDevP sur l'augmentation du volume LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. B) La fonction diastolique représentée par EDP sur des volumes croissants LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. LVDevP: la pression ventriculaire gauche développée (systolique moins pression diastolique pression); Informatique: en fin de diastole.

Figure 3. Représentant ³¹ P RMN de coeur isolé perfusé de souris. Remarquez le pic relativement petite Pi. Dans un coeur perfusé aérobie fourni avec des acides gras ou du pyruvate en plus du glucose, ce pic devrait être minime. Pendant les périodes d'ischémie, ce pic augmente tandis que le pic PCr diminue. Remarquez l'épaule à la droite du pic α-ATP. Il s'agit de la contribution des molécules de NAD. Pi: phosphate inorganique; PCr: phosphocréatine; ATP: adénosine triphosphate.

Discussion

³¹ P RMN dans le coeur perfusé de Langendorff isolés de la souris fournit des données fiables et reproductibles. ^{3, 4} Toutefois, il est impératif que la canulation de l'aorte et de l'insertion du ballon LV sont bien faites pour permettre une telle performance cardiaque stable tandis que l'intérieur de la RMN tube. En outre, la régulation de température est primordiale pour réaliser la fonction de base correcte. Un facteur important pour obtenir une bonne, spectres RMN analysables augmente le rapport signal sur bruit. Ceci peut être réalisé en assurant optimale "tuning" et "caler" sur l'échantillon. Comme mentionné dans le texte du protocole, l'utilisation d'un échantillon standard avant l'insertion du cœur peut faciliter ce processus. Il est également utile d'avoir une taille adéquate "échantillon". Coeurs pesant moins de 100 mg fournissent généralement inférieure PCr et de l'ATP afin signaux augmentation du temps d'acquisition sera nécessaire d'obtenir des spectres de phosphore bonne.

Il estplusieurs manières de modifier le protocole existant pour recueillir des renseignements supplémentaires sur la fonction cardiaque et de l'énergétique. Dans notre laboratoire, nous avons perfusé coeurs avec des tampons de substrats mixtes qui peuvent inclure la présence de différentes combinaisons d'acides gras (à des concentrations basses et hautes), le lactate, cétones, et l'insuline. Avec l'utilisation des isotopes stables dans le tampon de perfusion ^(c.-à-13 C substrats marqués), nous possédons la capacité d'évaluer l'utilisation du substrat par la contribution relative de l'acétyl-CoA marqué le cycle de Krebs. ^5-7 Pour cette application, nous effectuons isotopomère analyse de ^13-C3 et ^C4-13 glutamate de spectroscopie ¹³ C-RMN. Ce gel-serrage nécessite le coeur à la fin de la perfusion de protocole et en effectuant une extraction de tissu congelé. Ce sera une expérience supplémentaire que l'analyse requiert l'utilisation d'une sonde différente avec des paramètres de configuration séparés. D'autres applications incluent l'substitution du glucose avec désoxyglucose dans le tampon, tout en surveillant l'accumulation en fonction du temps de 2-désoxyglucose phosphate dans le coeur en utilisant la spectroscopie RMN ³¹ P. Cette méthode permet la mesure de l'absorption du glucose myocardique. ^{7, 8} En outre, notre laboratoire a analysé la fonction cardiaque et énergétique dans les protocoles de perfusion constitués d'ischémie / reperfusion et le défi charge de travail élevée. ^{6, 8-10}

En résumé, ³¹ P RMN dans les cœurs de souris isolées est une procédure techniquement difficile nécessitant l'utilisation d'équipements sophistiqués. Toutefois, les données qu'elle donne une valeur inestimable pour le chercheur qui souhaite analyser la fonction et le bilan énergétique de modèles de souris transgéniques. Pour notre laboratoire, ces techniques ont joué un rôle essentiel dans notre compréhension des conséquences d'une variété de facteurs de stress sur la fonction cardiaque, l'énergétique et le métabolisme. ^{1, 11, 12}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du produit	Type	Entreprise	Numéro de catalogue
Sulfate de magnésium	Réactif	Sigma Aldrich	M7506
EDTA	Réactif	Sigma Aldrich	E1644
Le chlorure de potassium	Réactif	Sigma Aldrich	P4505
Le bicarbonate de sodium	Réactif	Sigma Aldrich	S6297
De chlorure de sodium	Réactif	Sigma Aldrich	S7653
Chlorure de calcium dihydraté	Réactif	Sigma Aldrich	C5080
Le D-glucose	Réactif	Sigma Aldrich	G7528
Pyruvate de sodium	Réactif	Sigma Aldrich	P2256
Bruker UltraShield 600WB plus	Équipement	Bruker	& Nbs p;
PowerLab 4/30	Équipement	ADInstruments	ML866 / P
LabChart 6 Pro	Équipement	ADInstruments	MLS260 / 6
Quad Pont Amp	Équipement	ADInstruments	s.com/products/hardware/corporate/product/FE224 / "target =" _blank "> ML224
Contrôleur de pompe STH	Équipement	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Pompe péristaltique	Équipement	ADInstruments	ML172
Transducteur BP jetable	Équipement	struments.com "target =" _blank "> ADInstruments	MLT0699
Tube 10mm échantillon RMN	Équipement	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
PE10 tuyaux en polyéthylène	Équipement	Becton-Dickinson	427401
Capteur de pression physiologique	Équipement	ADInstruments	MLT844
PE50 tuyaux en polyéthylène	Équipement	Becton-Dickinson	427411
Seringue micrométrique	Équipement	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson forceps	Équipement	Miltex Inc	18-949
Microciseaux Castraviejo	Équipement	Instruments chirurgicaux Roboz	RS-5650
Conditionneur de signal Neoptix	Équipement	Neoptix, Inc	Reflex - 1