Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l'acrylamide basée hydrogels

Summary

L'effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être modélisé In vitro En utilisant des hydrogels de polyacrylamide de différentes conformités.

Abstract

La rigidité des tissus est un déterminant important de la fonction cellulaire, et des changements dans la rigidité des tissus sont couramment associés à la fibrose, le cancer et les maladies cardiovasculaires ^1-11. Des approches traditionnelles de cellules biologiques à l'étude de la fonction cellulaire impliquent la culture de cellules sur un substrat rigide (plats en plastique ou en lamelles de verre) qui ne peuvent pas rendre compte de l'effet d'un ECM élastique ou les variations de la raideur d'ECM entre les tissus. Pour le modèle in vivo les conditions de conformité des tissus in vitro, nous et d'autres utilisent ECM enduits hydrogels. Dans notre laboratoire, les hydrogels sont à base de polyacrylamide qui peut imiter la gamme de tissus conformités vu biologiquement ^12. «Réactive» lamelles sont générés par une incubation avec NaOH suivie par l'addition de 3-APTMS. Le glutaraldéhyde est utilisé pour réticuler la 3-APTMS et le gel de polyacrylamide. Une solution d'acrylamide (AC), le bis-acrylamide (Bis-AC) et le persulfate d'ammonium est utilisé pour la polymérisation de l'hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) est incorporé dans la solution CA pour réticuler ECM de protéines pour l'hydrogel. Après la polymérisation de l'hydrogel, la surface du gel est recouvert d'une protéine d'ECM de choix tels que la fibronectine, vitronectine, collagène, etc

La rigidité d'un hydrogel peut être déterminé par la rhéologie ou la microscopie à force atomique (AFM) et ajustée en faisant varier le pourcentage de CA et / ou le bis-AC dans la solution ^12. De cette manière, la rigidité du substrat peut être adaptée à la rigidité des tissus biologiques qui peuvent également être quantifiés à l'aide de rhéologie ou AFM. Les cellules peuvent ensuite être ensemencées sur ces hydrogels et cultivée en fonction des conditions expérimentales nécessaires. Imagerie des cellules et leur récupération pour l'analyse moléculaire est simple. Pour cet article, nous définissons des substrats souples que ceux ayant modules d'élasticité (E) <3000 Pascal et substrats rigides / tissus comme ceux avec E> 20 000 Pascal.

Protocol

Préparation

• Lamelles doivent être autoclavés.
• Eau distillée stérile ou déminéralisée doit être utilisée pour préparer des solutions et des lamelles à laver.
• AC (40% p / v) et de bis-secteur (1% p / v) solutions sont stérilisées par filtration 0,2 um. Préparer le persulfate d'ammonium à 10% (APS, l'eau 100μg/ml) peu avant l'utilisation et le filtre stérile. Remplacer la solution APS mensuelle.
• Réactifs chimiques tels que 3-APTMS, le chloroforme, glutaradehyde, NHS, et SurfaSil qui ne peuvent pas être autoclavés sont conservés dans une bouteille assigné utilisés uniquement pour la préparation d'hydrogels.
• Pour de meill....

Discussion

Un élément crucial du processus de polymérisation hydrogel est d'éviter la formation de bulles d'air qui permettent aux cellules de se lier à la lamelle de verre plutôt que l'hydrogel ECM revêtement lui-même. Ceci peut être évité en prenant soin de pipetage la solution de polymérisation après vortex et visuellement en s'assurant qu'aucune bulle d'air sont devenus piégés dans le gel. Nous recommandons toujours la préparation supplémentaires "réactive" des lamelles et des hydrogels pour s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldéhyde, 70 %	Sigma-Aldrich	G7776	Magasin à -20° ; C
3-APTMS (3-Aminopropyltriméthosysilane 97 %)	Sigma-Aldrich	281778	Conserver à température ambiante
Fluide de siliconation SurfaSil Thermo	Fisher Scientific, Inc.	42800	Conserver à température ambiante
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Conserver à 4° ; C Remplacer
l’albumine mensuelle, le sérum bovin, essentiellement sans acides gras	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Conserver à 4° ; Lamelles en C
(25 mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Couvertures (18 mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D