Le modèle organotypiques d'hippocampe Culture Slice d'examen des lésions neuronales

Résumé

Le modèle de l'hippocampe organoptypic la culture tranche est une In vitro Modèle utilisé pour examiner les lésions neuronales dans une variété de paradigmes. Dans cet article, nous décrivons les méthodes pour générer des cultures tranche et la quantification des lésions neuronales.

Résumé

Organotypiques la culture tranche de l'hippocampe est une méthode in vitro pour examiner les mécanismes de lésions neuronales dans laquelle l'architecture de base et la composition de l'hippocampe est relativement préservée ^1. Le système de culture organotypique permet pour l'examen des effets neuronaux, astrocytaire et microgliale, mais comme une préparation ex vivo, ne tient pas compte des effets de la circulation sanguine, ou le recrutement de cellules inflammatoires périphériques. À cette fin, cette méthode de culture est souvent utilisé pour examiner des blessures hypoxiques excitotoxique et aux neurones pyramidaux de l'hippocampe, mais a également été utilisée pour examiner la réponse inflammatoire. Ici nous décrivons les méthodes pour générer des cultures tranche de l'hippocampe du cerveau de rongeur postnatale, l'administration de stimuli toxiques pour induire des lésions neuronales, et en dosant et en quantifiant la mort neuronale hippocampique.

Protocole

1. Préparation

Avant de commencer, réunissez les instruments nécessaires chirurgicale, la dissection et les milieux de culture, et 7 jours vieux rat ou de souriceaux. Le protocole est le même pour les souris et les préparations de rat.

(I) Les matériaux et équipements

• Ciseaux d'exploitation (longueur droite 6 ", le chat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro dissection ciseaux, (longueur 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Acier au carbone Dumont pince à épiler (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Mise à jour de verre "transfert" des pipettes (en bas de pipette Pasteur enlevé et lissée de bord)
• Aclar film plastique coupé à 2 "en x 2" en carrés (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
• Couverture des éponges 4 en de 3 po (Kendall, le chat # 3157, rue Mansfield, MA)
• 30 mm à membrane Millicell inserts (0,4 um; Millipore, Bedford, MA)
• Tissue chopper Mcllwain avec une lame de rasoir à double tranchant (tissue chopper McIlwain, Société Vibratome, St. Louis, MO)
• Microscope inversé avec caméra CCD et un logiciel d'analyse d'image

Dissection moyen (ii) (DM; 1 litre à pH 7,3)

Balanced Salt Hank	1 flacon (95,2 g/1L) (Sigma: H2387)
NHCO 3 (4,2 mm)	350 mg
HEPES (10 mM)	2,83 g
Le glucose (33,3 mM)	6,0 g
Pénicilline / streptomycine (100x)	10 ml
BSA (0,3%)	300 mg
MgSO 4 7H 2 O	1,44 g

Le milieu de culture (iii) (400 ml)

MEM (Invitrogen 11575-032)	200 ml
*** Sel Bilan de Hank (Invitrogen 24020-117)	100 ml
Sérum de cheval (Invitrogen 26050-070)	100 ml
Tampon HEPES (1 M; Invitrogen 15630-080)	5 ml
Pénicilline / streptomycine (100x)	4 ml
*** Ajouter 12,8 g de glucose à Salt Équilibre 500 ml de Hank avant de faire un milieu de culture

(Iv) les animaux

7 jours ou de vieux rat souriceaux postnatale, en général une portée par l'expérimentation.

2. Lors de la Journée de la Culture

1. Tous les outils de dissection et le film Aclar doivent être trempées dans EtOH à 70% pendant 30 minutes avant de commencer. La surface de la hotte de dissection, lame, et chopper des tissus doivent être désinfectés avec de l'éthanol.
2. Préparez plusieurs (3-4) 6 ainsi plaques de culture tissulaire, ajouter 1 ml milieu de culture par puits, et insérez une membrane Millipore perméable dans chaque puits. Placer des plaques 6 puits dans le 37 ° incubateur jusqu'à prêt à transférer les tranches.
3. Préparez plusieurs (4-6) 60 plaques mm avec DM et placer sur la glace.
4. Rapidement décapiter avec des ciseaux et les tremper dans EtOH à 70%, et rapidement exposer le cerveau avec une incision sagittale du crâne. Retirer délicatement le cerveau et le place immédiatement dans un froid de DM. Le séparer en deux hémisphères et le lieu de chaque côté médial hémisphère vers le bas sur une éponge couvercle pendant 2-3 secondes.
5. Soulevez doucement et le lieu de l'hémisphère sur la place du film Aclar et les placer sur le broyeur de tissu et couper le cerveau coronaire dans 350 sections um. Lorsque vous avez terminé, amenez doucement la place à l'hémisphère Alcar sectionné et plonger dans un froid de DM.
6. En utilisant un microscope à dissection, séparer les sections hippocampiques. Pour le rat, il devrait y avoir cinq sections et s'étend à l'hippocampe rostrale caudale, et pour la souris il devrait y avoir des sections 3-4.
7. Sortez les assiettes de 6 puits avec des inserts de membrane de la 37 ° de culture de tissu incubateur. Transfert des coupes d'hippocampe individuellement sur les membranes perméables à l'aide de la pipette en verre. Si trop de DM est libéré sur la membrane, enlever l'excès de DM avec une pipette Pasteur. Placez cinq coupes d'hippocampe sur chaque membrane. Attendre au moins 3 puits par condition, ou 15 tranches.
8. Incuber les plaques de culture à 37 ° dans un 5% de CO incubateur humidifié pendant 12-14 jours avant le début de l'expérience de toxicité. Le milieu de culture peut être changé deux fois par semaine.

3. Induire et quantification des lésions neuronales hippocampiques en culture Slice

1. Après 12-14 jours de culture, ajouter 5 ug / ml d'iodure de propidium (PI) pour les milieux de culture. Cette étape permettra la visualisation et la quantification de la mort des cellules basales.
2. Le jour suivant, quantifier PIfluorescence dans la sous-région CA1 (et / ou CA3 ou denté si désiré) de chaque tranche de l'hippocampe et d'obtenir des mesures de PI signifie la fluorescence représentant la mort de cellules basales (appelé temps = 0 heures, ou T _0). Pour l'acquisition d'image et de quantification, nous utilisons des logiciels OpenLab (Improvisation, UK), mais l'acquisition d'image d'autres logiciels d'analyse et peut être utilisé pour quantifier l'intensité de fluorescence.
3. Immédiatement après l'acquisition d'image de T ₀ par fluorescence PI, provoquer des lésions neuronales par votre méthode de choix (nous avons utilisé 10 uM NMDA, l'oxygène-glucose privation, ou de LPS pendant une heure pour induire une toxicité neuronale ^2,5). Après la relance toxiques, remplacez moyenne avec un milieu frais contenant 5 ug / ml PI et de maintenir les tranches pendant la nuit.
4. Au jour 3, de quantifier la fluorescence de PI signifie la condition expérimentale à 24h, ou T _24.
5. Après cette acquisition d'image, changer immédiatement moyen et ajouter 10 uM NMDA et 5 pg / mL PI et les tranches incuber pendant la nuit pour atteindre maximale mort neuronale.
6. Au jour 4, de quantifier la fluorescence PI dire de la mort neuronale maximale, définie comme T _max. Calculer la mort cellulaire pour cent comme suit: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. Les résultats représentatifs

Figure 1. Ligne du temps (A) pour la production expérimentale de blessure de l'hippocampe et ultérieures et d'acquisition d'image. (B) des images représentant des coupes d'hippocampe basale (T _0), les 24 heures suivant une exposition de 1 heure à 10 uM (T ₂₄₎ NMDA, et après un 24h ou encore 10 uM NMDA pour obtenir maximale lésions neuronales (T _max).

Discussion

Il ya deux points importants à suivre pour assurer des résultats reproductibles et cohérents lors de la réplication des expériences. Premièrement, il est important de laisser l'âge hippocampique tranches pendant 12-14 jours avant l'expérimentation. Avec l'isolement tranche, il ya une réponse significative microgliales, et les microglies activées restent pendant un certain temps, avec un retour à un état ​​de repos ramifiées survenant au jour 10 in vitro de ^3,6. Deuxièmement, dire PI inten...