Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

Résumé

Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.

Résumé

Réplication inexacte dans la présence de dommages à l'ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et mutagenèse observée dans tous les types de cellules et est largement perçue comme étant directement associés au développement du cancer chez les humains. Dommages à l'ADN, telles que celle induite par une irradiation UV, altère sévèrement la capacité de réplication de dupliquer le modèle génomique précision. Un certain nombre de produits de gènes ont été identifiés qui sont nécessaires lorsque la réplication rencontres lésions de l'ADN dans le modèle. Toutefois, un défi reste a été de déterminer comment ces protéines lésions processus lors de la réplication

Protocole

1. La croissance et l'irradiation UV.

1. 200 ul d'une culture fraîche nuit contenant le plasmide pBR322 cultivées en moyenne ¹ Davis supplémenté en glucose 0,4%, 0,2% casaminoacides, et 10 pg / ml thymine (moyenne DGCthy) et 100 pg / ml ampicilline est granulé. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un milieu de DGCthy 200 pl manquent à l'ampicilline et utilisées pour inoculer 20 ml de milieu DGCthy.
2. Les cultures sont cultivées sans sélection à l'ampicilline dans un incubateur agitateur à 37 ° C à une DO ₆₀₀ de 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ cellules / ml). La croissance sans ampicilline évite la sélection contre ....

Discussion

Les résultats typiques obtenus à partir de cellules de type sauvage en présence et en absence de rayonnement UV-induite dégâts sont présentés dans la figure 1. En l'absence de dégâts, environ 1% de l'ADN plasmidique totale peut être trouvée dans l'arc Y lorsque les cellules sont en croissance rapide dans la phase exponentielle. Après irradiation, une augmentation transitoire de molécules en forme de Y est observé que les fourches de réplication bloquées s'accumuler aux sites endommagés. Les intermédiaire.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Exemple d'analyse Southern sur gel 2D sondé	GE Healthcare	G15T8	Éclairage jaune
Lampe germicide de 15 μwatt	Sylvania	F20T12/GO	Lampe UV
Mesureur d'intensité UV Blak-Ray 254 nm	Daigger	EF28195T	Photomètre UVC
Disques à pores de 0,025 μm	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Disques de dialyse flottants
PvuII	Fermentas	ER0632	Endonucléase de restriction
Kit de traduction par entaille	Roche Group	976776	Pour fabriquer une sonde marquée au 32P
Papier buvard	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Pour le transfert Southern
Membrane en nylon	GE Healthcare	RPN203S	Pour le transfert Southern