Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

Summary

Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.

Abstract

Réplication inexacte dans la présence de dommages à l'ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et mutagenèse observée dans tous les types de cellules et est largement perçue comme étant directement associés au développement du cancer chez les humains. Dommages à l'ADN, telles que celle induite par une irradiation UV, altère sévèrement la capacité de réplication de dupliquer le modèle génomique précision. Un certain nombre de produits de gènes ont été identifiés qui sont nécessaires lorsque la réplication rencontres lésions de l'ADN dans le modèle. Toutefois, un défi reste a été de déterminer comment ces protéines lésions processus lors de la réplication

Protocol

1. La croissance et l'irradiation UV.

1. 200 ul d'une culture fraîche nuit contenant le plasmide pBR322 cultivées en moyenne ¹ Davis supplémenté en glucose 0,4%, 0,2% casaminoacides, et 10 pg / ml thymine (moyenne DGCthy) et 100 pg / ml ampicilline est granulé. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un milieu de DGCthy 200 pl manquent à l'ampicilline et utilisées pour inoculer 20 ml de milieu DGCthy.
2. Les cultures sont cultivées sans sélection à l'ampicilline dans un incubateur agitateur à 37 ° C à une DO ₆₀₀ de 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ cellules / ml). La croissance sans ampicilline évite la sélection contre ....

Discussion

Les résultats typiques obtenus à partir de cellules de type sauvage en présence et en absence de rayonnement UV-induite dégâts sont présentés dans la figure 1. En l'absence de dégâts, environ 1% de l'ADN plasmidique totale peut être trouvée dans l'arc Y lorsque les cellules sont en croissance rapide dans la phase exponentielle. Après irradiation, une augmentation transitoire de molécules en forme de Y est observé que les fourches de réplication bloquées s'accumuler aux sites endommagés. Les intermédiaire.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Un exemple de l’analyse sud de la sonde gel 2D GE	Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 &mu ; watt lampe germicide	Sylvania	F20T12/GO	Lampe UV
Blak-Ray UV Intensité Meter 254nm	Daigger	EF28195T	Photomètre UVC
0.025 &mu ; m disques de pores	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Disques de dialyse flottants
PvuII	Fermentas	ER0632	Restriction Endonuclease
Nick-translation kit	Roche Group	976776	Pour fabriquer une sonde marquée 32P
Papier buvard	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Pour le transfert vers le sud
Membrane en nylon	GE Healthcare	RPN203S	Pour le transfert vers le sud