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L'induction et la surveillance des maladies chroniques récurrente EAE
L'émulsion est un mélange 1:1 de l'antigène en solution aqueuse ajoutée à compléter l'adjuvant complet de Freund. Il est très important d'ajouter l'antigène à l'adjuvant et non l'inverse!
Il ya beaucoup de déchets lors de l'injection et une émulsion. Toujours préparer 1,5 ou 2 fois plus que ce dont vous avez besoin.
Utiliser le mortier autoclavés, pilon, seringues en verre, et les ponts. Tous les plastiques doivent être stériles. La préparation peut être faite sur une paillasse de laboratoire régulières.
1. Préparation de l'adjuvant complété
Peser 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (catalogue # 231141 Difco) et mettre dans un mortier. Faire en poudre fine sans appuyer trop fort pour éviter de casser les bactéries. Ajouter 10 ml d'adjuvant complet de Freund H37Ra (Difco catalogue # 231131) et mélanger. Cet adjuvant contient maintenant complété 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis. Transférer dans un tube.
2. Préparation de l'homogénat de la moelle épinière
Recueillir la moelle épinière des rats de DA (âge / sexe indifférent) et de conserver congelés à -80 ° C. Peser les cordons congelés épinière d'avoir assez pour mélanger 1:1 (poids: volume) avec l'adjuvant complété. Emincez les moelles épinières aussi fine que possible avec une lame de rasoir, le transfert au mortier utilisé dans la section 1, et faire une pâte avec le pilon.
3. Préparation de l'émulsion
- Placez complété adjuvant complet de Freund dans un tube. Vortex à vitesse élevée. Ajouter la chute de la moelle épinière homogénat à goutte tout en vortex. Lorsque tous les homogénat de la moelle épinière est ajouté, vortex pendant 5 minutes. Le mélange doit tourner rose pâle.
- Mettez l'émulsion dans une seringue de 5 ml en verre et le lier à une autre seringue en verre de 5 ml à l'aide d'un pont 18G (catalogue Fisher n ° 14-825-17L). Envoyer l'émulsion d'une seringue à l'autre jusqu'à ce qu'il devienne dur (5-10 min). Si plus de 5 ml d'émulsion est préparée, l'utilisation de plusieurs seringues de 5 ml NE PAS utiliser de plus grandes seringues.
- L'émulsion peut être stockée dans les seringues à 4 ° C pendant 3 semaines. Je recommande le préparer au moins 12 heures à l'avance pour vérifier qu'il ne se décompose pas. Il devrait rester épaisse et non séparée en 2 phases. La couleur va changer du jour au lendemain d'une lumière jaune ou beige.
4. L'immunisation des rats
- Mélanger l'émulsion dans les seringues pendant quelques minutes et le transfert à la seringue utilisée pour l'injection. Injecter 200 pi sous-cutanée à la base même de la queue à l'aide d'aiguilles 23G et 3 ml Luer-Lock seringues sous anesthésie de courte durée.
- Les récipiendaires sont 7-9 semaines vieilles femelles rats DA. Nous obtenons nos rats de Harlan-Sprague-Dawley.
- Les rats doivent être observées deux fois par jour et pesés quotidiennement. Les signes cliniques sont attendus 7-15 jours après l'injection de l'émulsion.
Score clinique:
0: pas de maladie
0.5: la queue distale boite
1: la queue molle
2: paraparésie doux, une ataxie
3: paraparésie modérée, les déplacements des rats de temps en temps
3.5: un des membres postérieurs est paralysé, l'autre se déplace
4: paralysie complète des membres postérieurs
5: paralysie complète des membres postérieurs et de l'incontinence
6: moribonde difficulté à respirer, ne pas manger ni boire. Euthanasier immédiatement.