Article de méthode

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

DOI :

10.3791/2269

⸱

10 janvier 2011

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1Department of Energy, Environmental & Chemical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biomedical Engineering and Cardiac Bioelectricity and Arrhythmia Center, Washington University in St. Louis

Dans cet article

Résumé

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Courant ionique des canaux BK est enregistrée en utilisant des techniques de patch-clamp. Canaux BK sont exprimés en Ovocytes de Xenopus En injectant de l'ARN messager. La solution intracellulaire pendant les enregistrements de patch-clamp est contrôlé par un système de perfusion.

Résumé

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Le protocole présenté ici est conçu pour étudier l'activation de la conductance grande tension et de Ca 2 +-K + activé (BK) canaux. Le protocole peut également être utilisé pour étudier la relation structure-fonction pour d'autres canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs 1. Canaux BK sont largement exprimés dans différents tissus et ont été impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la réglementation de la contraction des muscles lisses, la fréquence d'accord de cellules ciliées internes et la réglementation de libération des neurotransmetteurs 2-6. Canaux BK sont activés par dépolarisation de la membrane et par intracellulaire de Ca 2 + et Mg 2 + 6-9. Par conséquent, le protocole est conçu pour contrôler à la fois la tension de membrane et la solution intracellulaire. Dans ce protocole, l'ARN messager de canaux BK est injecté dans des ovocytes de Xenopus laevis (stade V-VI), suivi de 2-5 jours d'incubation à 18 ° C 10-13. Patches membranaires qui contiennent un ou plusieurs canaux BK sont excisées avec la configuration inside-out en utilisant des techniques de patch-clamp 10-13. Le côté intracellulaire du patch est perfusé avec des solutions souhaitées lors de l'enregistrement de telle sorte que l'activation du canal dans des conditions différentes peuvent être examinés. Pour résumer, l'ARNm de canaux BK est injecté dans des ovocytes de Xenopus laevis pour exprimer des protéines de canal sur la membrane ovocytaire, les techniques de patch-clamp sont utilisés pour enregistrer les courants circulant dans les canaux sous tension contrôlée et des solutions intracellulaires.

Protocole

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1. L'injection d'ARNm dans des ovocytes

  1. Injecter 0,05 à 50 ng d'ARN messager qui a été transcrit in vitro dans des ovocytes de Xenopus laevis (stade V-VI) en utilisant Nanoject II Auto-injecteur nanolitres (Drummond Scientific Company, modèle 3-000-204). Répéter l'injection sur une douzaine d'ovocytes pour chaque ARNm.
  2. Rincez les ovocytes injectés à deux reprises avec ND-96 solution (96 mM de chlorure de sodium (NaCl, M. 58,44 g / mol), 2 mM de chlorure de potassium (KCl, M. 74,56 g / mol), 1,8 mM de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 O , M. 147.02), 1 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 O, M. 203,31 g / mol), 5 mM de 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, M. 238,31 g / mol), 2,5 mM pyruvate de sodium (M. 110,04 g / mol), et 1x pénicilline-streptomycine. pH 7,6), puis les placer dans une plaque de culture et incuber à 18 ° C pendant 2 jours +.

2. Préparer le système de perfusion

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Illustration du système Automatiser ValveLink perfusion 16. Le système de perfusion utilise de l'azote sous pression pour pousser les solutions de perfusion de la solution de réservoirs, à travers les tubulures de perfusion, et le crayon de perfusion et de pointe. Le débit de chaque flux de solution de perfusion est contrôlé par une valve du réservoir et une valve électronique. Dans ce protocole, l'un des réservoirs n'est pas sous pression et fonctionne comme un collecteur de déchets ainsi que d'un mécanisme de pression à la libération. (Image adapté de http://www.autom8.com site du vendeur)

  1. Connectez les tuyaux pour le crayon de perfusion. Mettez le contrôleur de valve électronique et ouvrir les vannes électroniques.
  2. Afin d'assurer que les tuyaux et le crayon de perfusion sont libres de bulles d'air et d'obstruer, poussez déminéralisée (DI) de l'eau à travers chaque tube à l'aide d'une seringue remplie d'eau déminéralisée.
  3. Connectez les tuyaux aux réservoirs de solution et ouvrir la vanne de gaz en bouteilles pour appliquer l'azote sous pression.
  4. Ouvrez le robinet de réservoir pour remplir le tube avec une solution réservoir. Flick la valve du réservoir pour éliminer les bulles dans la solution si nécessaire. Fermer le robinet après que le tuyau est rempli de solution.
  5. Remplissez la pointe de perfusion avec de l'eau et de le visser sur le crayon de perfusion. Soyez prudent de ne pas emprisonner les bulles lors de la connexion de la pointe.
  6. Fixer le crayon de perfusion à l'étape de bain à l'aide de pâte à modeler. Assurez-vous que la pointe de perfusion est dans l'espace bain. Le système de perfusion est maintenant mis en place.
  7. Ajouter de l'eau DI dans le bain. Assurez-vous que la pointe de perfusion est immergé dans l'eau.
  8. Testez que chaque solution de perfusion sort de la pointe de perfusion correctement. Fermer le robinet électronique relié à la tubulure du collecteur de déchets et ouvrir la vanne pour une solution de perfusion à un moment (140 mM d'hydroxyde de potassium (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxyéthyl) -1 - pipérazineéthanesulfonique (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de chlorure de potassium (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM éthylène glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tétraacétique (EGTA, M r 380,35 g / mol), le pH est ajusté à 7.1 à 7.2 par l'acide méthane sulfonique (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + ou Mg 2 + est ajouté à la concentration voulue en cas de besoin). Sous le microscope, observer le jet de liquide de perfusion sortant de la pointe de perfusion. Fermer le robinet pour solution pour perfusion et ouvrir la vanne du collecteur de déchets. Le jet de perfusion devrait presque disparaître. Répétez le même test pour toutes les solutions de perfusion.
  9. Lorsque vous avez vérifié que toutes les solutions de flux de perfusion correctement, remplacer l'eau DI dans le bain avec une solution de bain (140 mM d'hydroxyde de potassium (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique acide (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de chlorure de potassium (KCl, M r 74,56 g / mol), le pH est ajusté à 7.1 à 7.2 par l'acide méthane sulfonique (MESO 3, M r 96,1 g / mol)).

3. Patch clamp

  1. Recouvrir l'électrode d'enregistrement Ag avec AgCl avant chaque session de patch clamp. D'abord, enlever le fil électrode du porte-pipette et submerger la moitié extrémité du fil électrode dans un flacon contenant l'eau de Javel fraîche pendant au moins 15 minutes. Cette dépose une couche de AgCl sur le fil.
  2. Rincez le fil électrode avec de l'eau déminéralisée et sécher. Ensuite, installez l'électrode Ag / AgCl retour dans le porte-pipette.
  3. Connectez le bain (de référence) électrode à l'headstage et le placer dans le bain. Cela prépare les électrodes pour l'enregistrement.
  4. Maintenant préparer à l'acquisition de données. Allumez votre ordinateur et branchez la clé matérielle sur le port imprimante de votre ordinateur. La clé matérielle doit être branché pour vous d'utiliser le logiciel d'acquisition de données, ce qui est HEKA pouls.
  5. Allumez l'amplificateur (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) et commencer HEKA Pulse. Chargez le fichier de protocole et d'ajuster les paramètres de configuration, tels que l'échelle de stimulation. L'objectif pour ajuster les paramètres de configuration est d'assurer que le potentiel de test est exactement égal au potentiel de commande. Cela prépare le matériel d'acquisition de données.
  6. Préparer ovocytes. Immerger l'ovocyte dans la solution de décapage (200 mM de N-méthyl-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM d'aspartate (pas de K +) (133,1 M r g / mol), 2 mM de chlorure de potassium (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM d'éthylène glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM de 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, M r 238,31 g / mol), le pH est ajusté à 7,4 par l'hydroxyde de sodium (NaOH, M r 40,0 g / mol) pour 5 - 10 min. La solution de décapage se détache de la membrane vitelline de la membrane plasmique qui permet de dépouiller la membrane vitelline.
  7. Doucement la bande de la membrane vitelline de l'ovocyte à l'aide de deux paires de pinces. Un ovocyte devitellinized est extrêmement fragile et doit donc être déplacé aussi peu que nécessaire.
  8. Prendre soin d'éviter d'exposer l'ovocyte devitellinized à l'air ou de bulles, utiliser une pipette en verre remplie d'assez de solution pour transférer l'ovocyte dans le bain. Cela prépare l'ovocyte pour l'enregistrement.
  9. Préparer les pipettes de patch. Tirez les pipettes en verre après l'insertion d'un tube capillaire en verre (VWR International, Cat # 53432-921) dans un Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipette Puller. Respecter les pipettes sous microscope pour déterminer la forme de la pointe et le diamètre d'ouverture. Le diamètre d'ouverture devrait être 2-4 micromètres.
  10. Afin de réduire le courant capacitif pendant l'enregistrement et à assurer une astuce lisse, enduire la pointe avec de la cire, puis le feu-polonaise.
  11. Remplissez la pipette en plaçant la pointe de la pipette à l'intérieur de la solution de pipette (140 mM d'hydroxyde de potassium (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de chlorure de potassium (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), le pH est ajusté à 7.1 à 7.2 par méthanesulfonique l'acide (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) et le dessin du piston. Cette mouille le bout.
  12. Remplissez la pipette 1 / 3 plein avec une solution de pipette à l'aide d'une seringue et le lieu de la pipette dans le porte-pipette avec l'intérieur électrode Ag / AgCl et contact avec la solution pipette. Cela prépare la pipette de patch.
  13. Pour d'accise d'un patch à l'envers de l'ovocyte prêt, trouver le bord claire de l'ovocyte sous microscope. Déplacer la pipette de patch proche de l'ovocyte à l'aide manipulateur. Enregistrement de la résistance série de la pipette. La résistance série idéale de la pipette de patch est entre 1-1,5 MQ quand il est rempli avec une solution de pipette et submergés dans une solution de bain.
  14. Poussez lentement la pipette contre l'ovocyte jusqu'à la résistance à double approximativement.
  15. Appliquer une aspiration douce à la membrane par la bouche à travers un tube d'aspiration qui est relié au porte-pipettes jusqu'à un giga-ohms joint est obtenu. Stabiliser le patch en le tenant à la tension -30 mV pour un couple de minutes.
  16. Pour obtenir un dedans-dehors de patch, le patch en accise rapidement pousser plus loin la pipette dans l'ovocyte et puis doucement le tirant.
  17. Le patch inside-out est maintenant prêt pour le serrage. Déplacer la pipette tenant le patch à l'envers à environ 100 microns loin de l'ouverture de la pointe de perfusion.
  18. Fermer le robinet électronique pour la collecte des déchets et ouvrez le robinet de réservoir pour la solution de perfusion désirée
  19. Commencez l'enregistrement des courants à travers le patch. Changer les solutions de tension et de la perfusion comme désiré.
  20. Lorsque vous avez terminé l'enregistrement, nettoyer les tubulures de perfusion, le crayon et la pointe en poussant dans l'eau déminéralisée pour éviter sabots.

4. Les résultats représentatifs

Pendant la préparation d'ovocytes pour le patch-clamp, le traitement 5-10 min d'une solution de décapage serait détachent de la membrane vitelline de la membrane plasmique, ce qui rend possible de décapage de la membrane vitelline.

La résistance série idéale de la pipette de patch est entre 1-1,5 MQ quand il est rempli avec une solution de pipette et submergés dans une solution de bain.

Voici un enregistrement représentant de canaux BK de type sauvage sur un patch de membrane ovocytaire. En haut à gauche, les ondes carrées indiquent la tension appliquée au patch - la deuxième étape de la tension augmente de 50 mV à 200 mV avec incrément de 50 mV. Ci-dessous, les traces correspondant courant lorsque la solution de perfusion a nominale 0 Ca 2 + (libre [Ca 2 +] est d'environ 0,5 nM). L'aupli de l'amplitude du courant indique que la probabilité d'ouverture des canaux BK augmente avec la tension. Sur le côté droit, le même patch est perfusé avec 1,0 uM de Ca 2 + lorsqu'elle est appliquée avec le protocole même tension. L'amplitude du courant augmente plus sous la même tension, ce qui indique que la probabilité augmente avec l'ouverture [Ca 2 +].
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Discussion

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Le système d'expression ovocyte est idéal pour la caractérisation électrophysiologique des canaux ioniques voltage-dépendante due à fond relativement faible des canaux endogènes. Par ailleurs, puisque c'est un système d'expression transitoire, il fournit une méthode efficace de réaliser l'étude de mutagenèse de ces canaux. Cependant, il convient de noter que le système d'expression d'ovocytes est différente de celle des cellules de mammifères, donc il peut y avoir des différences dans modificatio...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé et la R01-R01-HL70393 NS060706 d'JCJC est un professeur de génie biomédical de la dotation Spencer T. Olin.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nanoject II Auto-Nanoliter InjecteurDrummond Scientific3-000-204
P-97 Extracteur de micropipette flamboyant/brunSutter Instrument Co.P-97
et contrôleur électroniqueAutoMate Scientific, Inc.ValveLink 16Diamètre intérieur de la pointe de perfusion : 100 microns
Microscope inverséOlympus CorporationCKX31
Pipettes en verreVWR international53432-921
Extracteur de micropipette flamboyant/brunSutter Instrument Co.P-97
AmplificateurAxon InstrumentsAXOPATCH 200B
Interface OrdinateurINSTRUTECH CorporationITC-18
HeadstageAxon InstrumentsCV 203BU
Système de perfusion

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
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