Nous décrivons une méthode simple, rapide et robuste pour la formation de Candida albicans Biofilms en utilisant des plaques de microtitration 96 puits et son utilité dans les tests de sensibilité antifongique de cellules au sein des biofilms.
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Article de méthode
Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms
Dans cet article
Résumé
Résumé
Candida albicans reste la cause la plus fréquente des infections fongiques chez une population en expansion des patients compromise et la candidose est maintenant le troisième plus fréquente d'infection dans les hôpitaux américains. Différentes manifestations de la candidose sont associés à la formation de biofilm, à la fois sur tissus de l'hôte et / ou des dispositifs médicaux (cathéters par exemple). La formation du biofilm porte négatives implications cliniques, comme les cellules dans le biofilm sont protégées par des réponses immunitaires de l'hôte et de l'action des antifongiques. Nous avons développé un modèle simple, rapide et robuste in vitro pour la formation de C. biofilms albicans aide de 96 puits de microtitration-plaques, qui peut également être utilisé pour tester la sensibilité aux antifongiques biofilm. La lecture de ce dosage est colorimétrique, basée sur la réduction du XTT (un sel de tétrazolium) par les cellules métaboliquement active biofilm fongique. Une expérience typique dure environ 24 h pour la formation de biofilms, avec un supplément de 24 h pour les tests de sensibilité aux antifongiques. En raison de sa simplicité et l'utilisation de matériel de laboratoire couramment disponibles et des équipements, cette technique démocratise la recherche biofilm et représente une étape importante vers la normalisation des tests de sensibilité aux antifongiques des biofilms fongiques.
Protocole
1. Préparation de C. albicans
C. albicans est un microorganisme 1/BSL1 des risques du Groupe. Rappelez-vous toujours à la bonne utilisation des techniques aseptiques / stériles pour travailler avec ce micro-organisme et de suivre les procédures institutionnelles pour l'élimination appropriée des matériaux biologiques dangereux.
- Préparer une culture de nuit de C. albicans dans YPD (levure-peptone dextrose) milieu liquide en inoculant une seule colonie de C. albicans dans 25 ml de YPD.
- Incuber la culture dans un agitateur orbital (environ 180 rpm) à 30 ° C pendant la nuit. C. La
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Discussion
Nous décrivons ici un moyen simple, rapide, économique et hautement reproductibles 96 modèle bien microplaque pour la formation de biofilms à Candida couplée à une méthode colorimétrique qui mesure l'activité métabolique des cellules au sein du biofilm en utilisant XTT. Ce modèle bien 96 microplaque pour la formation de biofilms a été initialement développé pour C. albicans, mais peut être utilisé pour d'autres espèces de Candida. et facilement adaptable à d'autres organismes fongi.......
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Déclarations de divulgation
JLL-R possède une participation dans les technologies MicrobeHTS, Inc, qui est le développement d'agents antifongiques. Technologies MicrobeHTS, Inc fourni aucune aide financière pour ces études.
Remerciements
Biofilm liés travailler dans le laboratoire est financé par des subventions et numérotées R21DE017294 R21AI080930 de l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale et l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (pour JLL-R.). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'NIDCR, le NIAID ou du NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar Sabouraud-dextrose | BD Biosciences | 211584 | Pour préparer des plaques destinées à des sous-cultures fraîches d'isolats fongiques |
| YPT : extrait de levure, peptone, dextrose | US Biological | Y2076 | Milieu de propagation pour des cultures liquides de 24 heures |
| RPMI-1640 sans bicarbonate de sodium, supplémenté avec de la L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Milieu liquide pour la formation de biofilms |
| Acide morpholinopropanesulfonique (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Pour tamponner le RPMI 1640 |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tampon utilisé pour les lavages |
| Sel de sodium du XTT | Sigma-Aldrich | X4251 | Voir ci-dessus pour les instructions de préparation |
| Lactate de Ringer’s | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Pour la préparation de la solution de XTT |
| Ménadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Attention : dangereux par contact cutané, inhalation ou ingestion |
| Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Tubes coniques de centrifugation de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Tubes coniques de centrifugation de 50 ml | Corning | 430828 | |
| Plaques microtitration à 96 puits : en polystyrène, fond plat, traitées pour culture cellulaire | Corning | 3595 | |
| Pipette multicanal et embouts | Eppendorf | ||
| Incubateur | Tout fournisseur | ||
| Lecteur de plaques microtitration | Tout fournisseur |
Références
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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Réimpressions et autorisations
