Analyse de cellules souches pluripotentes en utilisant cryocoupes de corps embryoïdes

Summary

Les cellules souches pluripotentes croissante en suspension se différencier en corps embryoïdes (EBS). Ici, nous montrons comment obtenir de haute qualité cryocoupes EB utile pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'embryogenèse, tout en préservant leur organisation en tant que granulats.

Abstract

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne de blastocyste-stade précoce des embryons de mammifères ^1. Une étape cruciale dans la différenciation des cellules ES est la formation de corps embryoïdes (EB) des agrégats ^{2, 3.} La formation EB est basée sur l'agrégation spontanée lorsque les cellules ES sont cultivées en plaques non adhérentes. Récapitule EB tridimensionnelle de nombreux aspects de l'embryogenèse chez les mammifères début et se différencient en trois feuillets embryonnaires: ectoderme, mésoderme et endoderme ^4.

Immunofluorescence et hybridation in situ sont largement utilisés des techniques pour la détection des protéines cibles et de l'ARNm dans les cellules d'une section de ^{5 tissus, 6, 7.} Nous présentons ici une technique simple pour générer cryocoupes haute qualité de corps embryoïdes. Cette approche repose sur l'orientation spatiale d'intégrer EB en OCT suivie par la technique cryosection. Les sections qui en résulte peut être soumis à une grande variété de procédures analytiques afin de caractériser les populations de cellules contenant certaines protéines, ARN ou ADN. En ce sens, la préparation de cryocoupes EB (10 microns) sont des outils essentiels pour l'analyse histologique coloration (par exemple hématoxiline et l'éosine, DAPI), l'immunofluorescence (par exemple Oct4, nestine) ou l'hybridation in situ. Cette technique peut aussi aider à comprendre les aspects de l'embryogenèse à l'égard du maintien de la structure tri-dimensionnelle sphériques d'EBS.

Protocol

1. Fixation et cryoconservation

Les cellules souches pluripotentes ont été cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) inactivé à la mitomycine C et maintenus en DMEM/F12 complété par le remplacement KO 20% de sérum (KSR) et 8ng / mL de facteur de croissance des fibroblastes (FGF-2). Afin d'induire la formation de cellules H9 EB ont été transférés à des non-adhérents plats et cultivées pendant 7 jours, maintenus dans DMEM/F12 supplémenté avec 15% KSR ^8.

Note (!): Cette technique peut être utilisée pour EBS provenant de toute cellule souche embryonnaires pluripotentes et induits.

1. Recu....

Discussion

La méthode décrite ici fournit un facile à suivre le protocole pour obtenir PFA fixes sections de cryostat mince de corps embryoïdes utiles pour l'immunofluorescence et dans des essais d'hybridation in situ. Le cryocoupes résultant permettre l'étude des aspects cellulaires et moléculaires de cellules souches humaines différenciation embryonnaire, tout en préservant leur structure et leur organisation en tant que granulats.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Réactif de saccharose		Vetec	228
Réactif de paraformaldéhyde		Rieden-de Haë ; n	16005
Solution PBS	Réactif	LGC Biotecnology	13-30259.05
Bromhydrate de poly-L-lysine	Réactif	Sigma-Aldrich	P2636	200mg/mL dans l’eau
Tissue-Tek O.C.T. Réactif composé		Sakura Finetek	P2636
Réactif			solution de saccharose	10 % solution de saccharose p/v
Réactif			de solution de saccharose	20 % de saccharose Solution dans PBS avec
			saccharose	30 % de solution de saccharose dans PBS avec
outil de tube conique		Techno Plastic Products	91015	15mL tube conique
Agitateur	de	Outil Biomixeur
Cryostat	Outil	Leica Microsystems	CM 1850
Moule pour plate-forme OCT	Outil			Moule en plastique plataform