Summary
它被广泛了解，在体内的机械力可以影响细胞分化和增殖。在这里，我们提出了一个视频协议，显示了使用一个定制的生物反应器提供单向循环拉伸应变干细胞培养灵活micropatterned基板。
Abstract
在生物组织的发展和维护的机械力的作用是有据可查的，包括几个机械监管的现象，如骨重塑，肌肉肥厚，平滑肌细胞的可塑性。然而，涉及的力量往往是非常复杂和困难的监视和控制体内。为了更好地研究细胞的机械力的影响，我们已经制定了在体外采用单向循环拉伸应变的弹性膜贴壁细胞培养的方法。这种方法采用了机动凸轮转子系统定制设计的生物反应器，以申请所需的力。在这里，我们现在一步一步的视频协议，演示了如何组装的每一个“舒展室”的各个组成部分，在这种情况下，包括micropatterned地形的方向与应变方向的细胞与硅膜。我们还描述了消毒商会，播种到膜细胞，到生物反应器的闭锁室，和调整的力学参数（即幅度和应变率）的程序。在这个特殊的协议中所述的程序，具体到与10微米宽的通道方向平行方向的应变硅膜播种人类间质干细胞。然而，在这个系统中提出的方法和材料是灵活的，足以容纳一个关于这一主题的变化：应变速率，幅度，持续时间，细胞类型，地形膜，膜涂层，等等都可以根据所需的应用程序或的结果。这是一个可靠的方法，调查体外细胞应用于单轴拉伸应变的影响。
Protocol
0天 - 灭菌前一天的实验
- 材料放入塑料桶和消毒，用70％酒精2小时：
- 钱伯斯
- 盖
- 相框（3件）
- 螺丝
- 橡胶垫片
- 镊子
- 剪刀
- 六角扳手
- 用Aquet肥皂和蒸馏水清洁膜。
- 超声在10分钟的70％的酒精膜。
- 成塑料平方米美食广场的清洁膜。如果使用图案膜，确保图案的一面是面对（到膜的一侧喷酒精和观看的液体运行的凹槽）。
- 保留70％酒精2小时覆盖膜。
- 蒸压明天早上到铝箔包装手套。
- 蒸压明天，蒸馏水的2％（重量/体积）明胶溶液（2g/100mL）。
- 在70％酒精消毒2小时后，放入隔夜紫外线的防护罩所有高分子材料与膜（非高压灭菌材料）：
- 钱伯斯
- 盖
- 相框（3件）
- 膜
- 包成高温高压灭菌包的剩余材料：
- 螺丝
- 橡胶垫片
- 镊子
- 剪刀
- 六角扳手
第1天 - 拉伸商会大会
- 高压灭菌镊子，剪刀，六角扳手，螺丝，垫圈，手套，并在240 ° F明胶使用总共20分钟的小反应釜
- 删除免受紫外线膜和治疗用氧等离子体（图案的一面向上）〜1分钟。
- 在TC罩，封面图案与明胶等离子处理后的膜面积。大衣30紫外光下分钟。
- 每个膜用PBS 2X洗净。第二次洗涤后，留下一些PBS膜，使他们湿滑，更容易进入商会的大会。 （也应该使用此PBS润滑容易装配的垫片）。
- 到商会组装膜（穿在组装过程中的灭菌手套）
- 连接两个帧，使用一台单螺杆主件。
- 翻转帧上放置一个顶部朝框架，使明胶包侧面（图案面积应在中心）膜。
- 安全膜帧，每方使用一个垫片。
- 按垫片，使用温和的，甚至压力，以免撕裂膜。
- 将装配架T - BAR。
- 翻转到商会的框架和地方倒挂。框架和膜的紫外线30分钟的背面
- 再次翻转帧，并进入商会（控制室没有改变，但舒展室，需要用两个螺丝将这块室底部框架，需要删除的单螺杆螺丝帧的两件）。 30分钟的紫外线前端。确保膜完全干燥，然后再继续下一步，否则电池解决方案可能会滑在播种。
- 种子细胞。 1 = 3膜板区的面积，因此使用一个每膜融合板的1 / 3。使用1毫升每膜细胞液。任何超过1.5ml的将难以跟上解决方案。图案的面积上只放电池解决方案，并用吸头周围传播解决方案。包括商会及让细胞附着在引擎盖RT 30分钟。
- 移动商会孵化器，让细胞附着1小时。移动分庭，以避免让电池解决方案滑落，必须非常小心！如果在这一点上脱落的解决方案，该商会的细胞就会被葬送。
- 返回室罩和添加20毫升媒体。
- 用铝箔覆盖（也用酒精喷洒）酒精清洗浴缸的地方，那就是商会。移动商会舒展孵化器（10％的CO 2）。
- 到拉伸机的安全室。让细胞进一步重视过夜，第二天就开始舒展。 （ 注 ：投入拉伸机室时，请记住“零”的位置锁定在机前放置商会，然后拧紧齿轮周围的橡皮筋不要忘记解锁之前，启动机的齿轮）。
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Discussion
巴内斯等。首次报道在体外培养细胞的机械性刺激，通过使用一个灵活的弹性基材提供机械力1细胞的系统使用。这段时间以来，这种设计上的许多变化已经构思和利用。几个机械牵张系统市售的名义下“Flexercell”（Flexcell国际公司），而一些实验室使用定制的设备。在这个视频协议，我们已经描述了一个这样的设备的安装和使用，在我们的实验室。
本议定书中所描述的定制的“拉伸机”已被用来在不同的研究，调查不同类型的细胞的单轴循环应变2,3的影响。本机是一种与几个可调参数，可用于各种机械应力研究使用的多功能仪器。此处所描述的设置代表一个独特文化提供单轴循环应变贴壁细胞和可靠的方法。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
