Imagerie bioluminescente de la progression d’une tumeur mammaire dans un modèle murin femelle

Résumé

Source:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Institut des sciences biologiques, Université de Brasília, ²Département des processus psychologiques fondamentaux, Institut de psychologie, Université de Brasília

Cette vidéo montre la procédure de suivi de la progression tumorale in vivo en injectant des cellules d’adénocarcinome mammaire exprimant la luciférase dans une souris femelle et en surveillant les signaux bioluminescents pour évaluer la croissance tumorale primaire et métastatique au fil du temps

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Culture cellulaire

1. Maintenir la lignée cellulaire 4T1 (ATCC-CRL-2539), une cellule d’adénocarcinome du sein murin, en culture avec un milieu DMEM (milieu d’aigle modifié de Dulbecco) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (v :v), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL), à 37 °C et dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
2. Transfectez la lignée cellulaire d’origine avec le gène Luc2, qui exprime la luciférase. Cette enzyme bioluminescente est produite de manière constitutive.

2. Modèle animal - Greffe de cellules tumorales

1. Inoculer par voie sous-cutanée des cellules 4T1 bioluminescentes, exprimant la luciférase (2 × 10^{à 5} cellules par souris) dans le dos gauche de souris femelles Balb/c sous anesthésie (kétamine et xylazine à 80 mg/kg et 10 mg/kg, respectivement).
   1. Pour cette procédure, anesthésie la souris avant l’expérience en utilisant l’injection intrapéritonéale des agents anesthésiques spécifiés (kétamine et xylazine à 80 et 10 mg/kg, respectivement).
   2. Après 5 minutes d’induction de l’anesthésie, rasez la souris et injectez les cellules par voie sous-cutanée à l’aide de seringues à insuline de 1 ml.
      REMARQUE : Un total de cinq souris âgées de 8 semaines, pesant environ 25 g chacune, ont été utilisées pour l’induction et l’imagerie de la tumeur.
2. Pour quantifier la croissance tumorale in vivo, évaluez la souris porteuse de la tumeur par imagerie bioluminescente, en surveillant la croissance tumorale pendant 4 semaines.
   1. Pour les expériences de bioimagerie, anesthésie la souris avec de l’isoflurane (2,5 % dilué dans de l’air comprimé purifié). Pour évaluer la progression tumorale, imagez la souris une fois par semaine pendant 4 semaines à l’aide d’un équipement qui mesure les signaux bioluminescents.
      NOTE: Le signal bioluminescent de la luciférase 4T1-luc a été utilisé comme paramètre pour évaluer la croissance et indiquer la progression tumorale.
3. Pendant le processus d’imagerie, positionnez la souris en position couchée dorsale dans la zone désignée de l’équipement pour capturer les images bioluminescentes.
4. Après l’anesthésie, injectez à la souris de la D-luciférine (100 μL ; 15 mg/mL) par voie intrapéritonéale.
   NOTE: Étant donné que la D-luciférine est un substrat de l’enzyme luciférase, qui produit des photons légers lorsqu’elle est clivée, et que les cellules luciférases bioluminescentes 4T1 expriment cette enzyme de manière constitutive, quantifient et détectent la tumeur chez les animaux vivants.
5. Pour détecter les signaux, capturez 20 images bioluminescentes sur 20 min pour chaque animal à chaque point d’extrémité. Chacune de ces images représente le signal bioluminescent émis sur une période de 60 s.
6. Construisez une courbe cinétique bioluminescente représentant le signal émis chaque minute. Pour garantir des résultats optimaux pour chaque animal, consignez l’émission bioluminescente maximale pour chaque endpoint.
7. Pour la capture d’images par bioluminescence, utilisez les paramètres suivants : filtre d’émission ouvert, sans excitation, binning 8, f/stop 2 et champ de vision de type D. Pour générer une courbe de croissance, imagez les animaux une fois par semaine pendant un total de 4 semaines.
8. Imagerie par bioluminescence - Tumeur primaire et métastases pulmonaires.
   1. Pour faire la distinction entre la tumeur primitive et les signaux de métastases pulmonaires, définissez des régions d’intérêt spécifiques à l’aide du logiciel de l’équipement.
   2. Identifier les signaux bioluminescents dans le site d’injection et la région thoracique où les cellules ont métastasé. Sur la base de ces images, calculez la progression du signal bioluminescent, qui est fortement corrélée à la progression tumorale.
   3. À l’aide d’images collectées sur plusieurs semaines, créez un profil cinétique de croissance pour les différents sites tumoraux, y compris la tumeur primaire et les lésions métastatiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
D-luciférine	Perkin Elmer	122799	Réactif chimique
Médium de l’aigle modifié de Dulbecos	Gibko	A7030	Milieux de culture cellulaire
Sérum fœtal bovin	Merck	Réf. F2442	Supplément pour milieux de culture cellulaire
L’isoflurane	Cristália	NA	Anesthésiques
IVIS Lumina	XR	Série III	Équipement – États-Unis
Pénicilline	Merck	Réf. P4333	Antibiotique de culture cellulaire
Phalloïdine-Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	N° A12379	Réactif chimique
Tampon phosphate salin	Merck	4437568	Réactif chimique
Streptomycine	Merck	Réf. P4333	Antibiotique de culture cellulaire