Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

Résumé

Une méthode pour livrer morpholinos directement dans le poisson-zèbre à l'otocyste 24hpf a été développé. L'utilisation de micro-injection d'morpholinos dans la lumière de la vésicule otique et l'électroporation à effet de pénétration, nous avons été en mesure de contourner l'effet de morpholinos sur le cerveau et obtenir des effets spécifiques de l'oreille interne.

Résumé

Ces dernières années, l'électroporation est devenue une technique populaire pour la transfection in vivo de l'ADN, l'ARN et morpholinos dans les tissus divers, y compris l'œil, du cerveau et des somites poisson zèbre. L'avantage de l'électroporation rapport aux autres méthodes de manipulation génétique, c'est que certains tissus peuvent être ciblées, à la fois spatialement et temporellement, pour l'introduction de macromolécules par l'application de courant électrique. Nous décrivons ici l'utilisation de l'électroporation pour la transfection et la mif mif-like morpholinos dans les tissus de l'oreille interne de l'élaboration du poisson zèbre. Dans les études antérieures, mif morpholino injectées dans des embryons à la une - au stade de 8 cellules a entraîné des modifications morphologiques très répandue dans le système nerveux et des yeux, ainsi que l'oreille. En ciblant les tissus de l'oreille interne à des stades ultérieurs de développement, nous pouvons déterminer les principaux effets de MIF dans l'oreille de développement interne, par opposition aux effets secondaires qui peuvent résulter de l'influence des autres tissus. En utilisant la tubuline acétylée phalloïdine et coloration pour étudier la morphologie des neurones, les processus neuronaux, et les cellules ciliées associées à la macula postérieure, nous avons été en mesure d'évaluer l'efficacité de l'électroporation comme une méthode pour la transfection ciblée dans l'oreille le poisson-zèbre intérieure. Les vésicules otiques d'embryons ont été injectés avec 24hpf morpholinos et électroporé et ont ensuite été comparés aux embryons qui n'avaient reçu aucun traitement ou avaient été injectés ou ne électroporé. Les embryons qui ont été injectés et électroporées ont montré une diminution du nombre de cellules de cheveux, une diminution de l'innervation par le ganglion statoacoustic (SAG) et les neurones en moins par rapport SAG avec des groupes de contrôle. Nos résultats ont montré que la prestation directe de morpholinos en otocystes à des stades ultérieurs du système évite non spécifiques nerveux et les effets de la crête neurale morpholinos livré au stade 1-8 cellules. Il permet également l'examen des effets qui sont dirigées vers l'oreille interne et non pas des effets secondaires sur l'oreille d'effets primaires sur le cerveau, de la crête neurale ou mésenchyme périotique.

Protocole

1. Fabrication d'électrodes pour l'électroporation

1. Couper 75 fils de tungstène um de diamètre (PM Systems, Inc Carlsborg, WA) de longueur appropriée (environ 3-5 cm)
2. Passez le fil de tungstène grâce molex câble connecteur (broche en laiton estampé)
3. Envelopper et des fils de tungstène connecteur du câble molex avec gaine thermorétractable (CPS Technology, Chicago, IL) et appliquer de la chaleur avec brûleur Bunsen ou pistolet à air chaud pour sceller le tube rétrécit au fil
4. Pour affûter la pointe de fil de tungstène, tremper le fil dans l'hydroxyde de sodium 1,0 N (Conrad et al. 1993) et, à l'aide d'un trombone que l'autre électrode, électrolyse le fil avec un Electroporateur onde carrée. Les conditions que nous utilisons sont de 5 à 50 volts impulsions d'une durée de 100 ms avec 50 ms entre les impulsions. Les électrodes doivent être affûtées à un diamètre de 15 à 20 um
5. Gardez les fils dans un plateau dans les rainures enfoncé dans la pâte à modeler avant l'utilisation dans l'électroporation

2. Set Up station électroporation

1. Ruban aiguisé 75μm électrodes de tungstène pour micromanipulateurs (instruments de précision du monde).
2. Micromanipulateurs place de chaque côté de la platine du microscope disséquant (Leica).
3. Brancher les électrodes à un Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier Place des vagues (figure 1).
4. Allumez le électroporateur et mettre en place des paramètres pour l'électroporation, y compris la tension, durée d'impulsion, et le nombre d'impulsions. Les paramètres les plus efficaces pour cette expérience ont été trouvés être de trois 13 volts impulsions qui ont duré chacune des 5.0ms, avec 100ms entre chaque impulsion. Si l'électroporation crée des bulles d'air dans l'embryon, de réduire la durée d'impulsion.

3. Microinjection d'morpholinos Into vésicule otique Zebrafish

1. Embryons de poissons zèbres récolte à partir d'un réservoir d'élevage. Incuber les embryons dans l'embryon de conscience moyenne, avec 0,3 PPM méthylène bleu (Westerfield, 2005) à 28,5 ° C pendant la nuit.
2. Tirez aiguilles de verre avec un extracteur Sutter P-97 électrodes
3. Warm up une base de gel d'agarose (1% d'agarose dans de l'eau du poisson dans un plat de Pétri de 10 mm) à 37 ° C dans un bain d'eau
4. Chauffer 1% d'agarose à faible point de fusion (EPMT) dans les poissons d'eau jusqu'à ce qu'il fonde et le garder au chaud dans le bain à 37 ° C.
5. Remplir une aiguille de verre avec une solution morpholino (GeneTools, Corvallis, OR) et couper l'extrémité d'un diamètre approprié. Montez l'aiguille d'injection sur un micromanipulateur (Kuhn).
6. Couper pointe de l'aiguille d'environ 10 um et les injecter dans l'huile minérale pour s'assurer que la pointe permet une livraison suffisante de solution morpholino.
7. Dechorinate embryons à 24 heures post-fécondation (HPF) et les anesthésier avec MS222 (tricaïne, Sigma) dans 0,3 ppm d'eau de méthylène poisson bleu.
8. Alignez 3 à 5 embryons anesthésiés sur la base de gel d'agarose avec le côté droit pour analyse uniforme commodes
9. Mettre 1 à 2 gouttes d'EPMT 1% sur chaque embryon et laissez solidifier à fixer l'embryon en place
10. Tournez la boîte de Pétri de telle sorte que la vésicule otique est sur le côté droit
11. Placez l'aiguille dans la lumière de la vésicule otique et injecter la solution avec un morpholino PicoPump PV820 pneumatique (instruments de précision du monde) avec un réservoir d'azote fixé (figure 2)

4. Procédure d'électroporation

1. Déplacer les embryons montée à la station de électroporation immédiatement après l'injection
2. Placer l'électrode positive sur le tissu juste derrière la vésicule otique, mais ne pénètrent pas, insérer l'électrode négative dans le cerveau juste en avant la vésicule otique
3. Appliquer en cours en utilisant une pédale ou en appuyant sur un interrupteur.
4. Versez de l'eau du poisson sur agarose et retirez embryons à partir d'agarose tourbillonnant et une pipette en verre. Faites preuve de prudence pour ne pas endommager l'embryon. Pour les embryons qui sont difficiles à enlever, utiliser une aiguille doucement rompre toute EPMT entourant l'embryon.
5. Embryons Placer dans un plat avec de l'eau du poisson bleu de méthylène et d'élever les embryons à des stades souhaités pour l'analyse (morphologique, immunohistochimique, dans anlaysis hybridation, etc et microscopiques in situ).

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Station de l'électroporation. Les électrodes ont été faites en utilisant des fils de tungstène affûté 75μm et reliés par un conduit Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier onde carrée. Ces électrodes ont été enregistrées au micromanipulateurs.

Figure 2. Station d'injection. Tous les embryons ont été injectés dans l'oreille droite à des fins de normalisation.

Figure 3. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 3 embryons DPF. (A) L'embryon injecte 3 dpfD avec contrôle MO a une forte coloration de la phalloïdine dans la macula postérieur (pm). (B) L'embryon qui a été injecté avec un contrôle MO puis électroporées avaient des niveaux similaires de coloration phalloïdine dans h dans les embryons d'injection seulement. (C) l'injection avec MOS mif dans la vésicule otique seul ne cause pas de réduction de la coloration phalloïdine, tandis que l'injection d'OM mif avec électroporation a provoqué une réduction spectaculaire de la coloration de la phalloïdine h (D). h, la macula antérieure.

Figure 4. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 5 larves DPF. Il n'y avait aucune différence entre l'injection seulement (A) et l'injection de l'électroporation, lorsque la norme de contrôle a été utilisé morpholino (B). Cependant, les larves 5 dpf qui ont été injectés avec mif morpholinos et électroporé montré réduite coloration phalloïdine dans la macula postérieure (h) (D), bien que moins spectaculaire que trois DPF, en comparaison avec l'embryon qui a été injecté avec mif morpholinos seulement (C ). h, la macula antérieure.

Figure 5. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf. L'embryon en (A) n'a pas reçu d'injection ou l'électroporation. L'embryon en (B) a été électroporé mais n'a reçu aucune injection. Embryons recevoir l'injection et l'électroporation (C, D) avec mif morpholinos avaient visiblement coloration tubuline diminué par rapport aux contrôles. (H, macula postérieur).

Figure 6. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf avec contrôle morpholino. (A) Embryon sans aucun traitement a montré une forte coloration tubuline acétylée dans la macula postérieur (pm) et l'innervation étendue. (B) avec contrôle de l'embryon injecté morpholino. (C) Embryon traités avec électroporation seulement. (D) d'embryon commande avec morpholino injecté et électroporées a des niveaux similaires de la tubuline acétylée dans la macula et l'innervation postérieure par rapport au témoin un traitement non.

Discussion

Nous avons introduit avec succès OM oligonucléotide antisens dans l'oreille de l'embryon de poisson zèbre 24 HPF. Les embryons qui ont été soulevées après l'injection et l'électroporation étaient viables. Si les embryons ont survécu à l'électroporation, ils ont progressé à des taux normaux par rapport à des embryons qui n'avaient reçu aucun traitement, ainsi que des embryons qui avaient seulement été injectés et les embryons qui avaient seulement été électroporé.

Nous avons observé les effets de la MIF et MIF, comme OM après l'injection d'oreille et l'électroporation grâce à l'étiquetage et la tubuline avec la phalloïdine acétylés. Phalloïdine coloration des filaments d'actine dans les cellules ciliées sensorielles de la macula postérieure indique que l'électroporation de MIF et MIF tels que MO au stade 24-HPF a provoqué des changements dans la cellule des cheveux et / ou des numéros de stéréocils par rapport aux embryons qui ont été injectés avec la seule OM (Figure 3). Cette diminution du nombre de cellules ciliées est cohérent avec les conclusions de Shen et al. (Soumis) que OM à mif mif-like et de provoquer une réduction du nombre de cellules ciliées dans la macula sacculaire. La diminution du nombre de cellules de cheveux chez les embryons qui ont été injectés avec les OM et électroporées démontrer que l'électroporation peut aider à déplacer l'OM à travers la membrane cellulaire, ce qui augmente l'étendue des effets morphologiques par rapport aux embryons dans lequel la vésicule otique était seulement injecté. Les changements dans la morphologie du ganglion statoacoustic ont été observées grâce à la tubuline acétylée coloration. L'étendue de l'innervation par le ganglion statoacoustic a été affectée, comme les embryons qui ont été injectés et électroporées montrent une diminution de branchement des neurites (figure 5). Il peut également être diminué de condensation des cellules ganglionnaires et / ou diminution du nombre de cellules ganglionnaires, parce que la coloration tubuline acétylée est significativement diminué chez les embryons qui ont été injectés à la fois et électroporé. Parce que MIF a été montré pour être critique pour le développement du système nerveux (Suzuki et al., 2004), les changements observés après l'électroporation peut être le résultat de la transfection accrue de la MIF et MIF, comme solution de MO dans les cellules neuroblastes.

L'électroporation des antisens morpholinos oligo directement dans un tissu en développement est un outil utile pour contrôler l'expression d'un gène au cours du développement que le tissu, à la fois spatialement et temporellement, dans l'embryon. L'électroporation de MIF et MIF-like OM dans les tissus de l'oreille interne conduit à une morphologie anormale des deux macula postérieur et le ganglion statoacoustic. Il y avait une réduction du nombre de cellules ciliées sensorielles dans la macula postérieure des embryons qui avaient été injectés et électroporées en comparaison avec les embryons qui n'avaient reçu aucun traitement ou avec des embryons qui avaient été soit seulement injecté ou seulement électroporé. Il y avait aussi une diminution du degré d'innervation du patch postérieure sensorielle par le ganglion statoacoustic et la taille de la SAG. L'électroporation est une méthode précieuse pour la transfection des macromolécules dans des tissus spécifiques, avec l'avantage d'observer les effets primaires de l'ADN notamment, de l'ARN, ou MO dans le tissu désiré et discriminant de ces d'effets secondaires sur d'autres tissus, y compris le cerveau, de la crête neurale et des mésenchyme périotique sur le développement oreille interne (Barald et Kelley, 2004).

Matériaux

1. OM: 0,3 mm d'une combinaison de des mif, mif-comme MO1 et MO2 mif-like a été utilisé.
   Mif MO est gratuit au codon d'initiation de l'ARNm de poisson zèbre MIF: 5'-acatcggcatgactgcgacagagat-3 '. Deux OM ont été utilisés pour mif mif-comme-comme MO1 est gratuit sur ​​le site de début de traduction:. 5'-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 ', tandis que le MIF, comme MO2 dérivé de la séquence à l'AS intron1/exon deux limites: 5'-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 '. Contrôle MO a été la séquence nucléotidique du brouillés Outils Gene: 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 '.
2. bleu de méthylène (0,3 ppm) dans les poissons d'eau
3. MS222 (tricaïne, Sigma; 0,64 mM dans l'eau du poisson)
4. Bas point de fusion d'agarose (EPMT; Roche)
5. rouge de phénol (Sigma)
6. Anti-acétylés tubuline (Sigma)
7. Alexa Fluor ® 488 de chèvre anti-souris second anticorps (Molecular Probes)
8. Texas Red-phalloïdine (Molecular Probes)