ARN interférence a été prouvé très efficace pour analyser la fonction des gènes dans Drosophile Développement trachéale. Un protocole détaillé utilisé par Jiang laboratoire pour injecter des ARNdb dans des embryons voler à l'expression des gènes knockdown est illustré. Cette technique a le potentiel pour le dépistage des gènes nécessaires au développement des tissus et des organes de Drosophile.
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Article de méthode
Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le dépistage génétique est l'une des méthodes les plus puissants disponibles pour obtenir un aperçu dans le processus biologique complexe 1. Au fil des ans de nombreuses améliorations et d'outils pour la manipulation génétique sont devenues disponibles chez la drosophile 2. Peu après la découverte initiale par Frie et Mello 3 qui ARN double brin peut être utilisé pour knockdown l'activité des gènes individuels chez Caenorhabditis elegans, l'interférence ARN (ARNi) a été montré pour fournir une puissante approche de génétique inverse afin d'analyser les fonctions des gènes chez la drosophile organes de développement 4, 5.
De nombreux organes, notamment du poumon, du rein, le foie et le système vasculaire, sont composés de réseaux ramifiés tubulaire transport de fluides vitaux ou de gaz 6, 7. L'analyse de la drosophile la formation trachéale fournit un excellent modèle pour étudier la morphogenèse des autres organes tubulaires 8. Le Berkeley Drosophila Genome Project a révélé des centaines de gènes qui sont exprimés dans le système de la trachée. Pour étudier le mécanisme moléculaire et cellulaire de la formation du tube, le défi est de comprendre le rôle de ces gènes dans le développement de la trachée. Ici, nous avons décrit une méthode détaillée d'ARNdb injection dans l'embryon de drosophile à l'expression des gènes knockdown individuels. Nous avons réussi à renverser l'expression des gènes endogènes dysfusion (dys) par injection ARNdb. Dys est une protéine bHLH-PAS exprimée dans les cellules trachéales de fusion, et il est nécessaire pour la branche trachéale de fusion 9, 10. dys-RNAi complètement éliminé l'expression dys et a abouti à la fusion anomalie trachéale. Cette méthode relativement simple fournit un outil pour identifier les gènes requried pour tissure et le développement des organes chez la drosophile.
Protocole
1. Collecte d'embryons
- Mettre en place des cages à 25 ° C en utilisant 2-4 jours âgé w 1118 plaques de jus flies.Grape sont changés tous les heures pendant la journée pour synchroniser le ramassage des œufs pendant 1-2 jours avant la collecte période
- Recueillir des embryons pour 1h à 25 ° C
- Couper une pièce rectangulaire d'agar jus de raisin, coupe légèrement au milieu avec une lame de rasoir, de laisser une ligne dans la gélose
- Utiliser une sonde métallique de transférer les embryons de la plaque de jus de raisin à votre morceau de agar jus de raisin, les aligner dans une ligne droite avec axe long de l'embryon ang....
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Discussion
La présente méthode d'injection permet ARNdb ici une analyse très sensible et rapide de la fonction des gènes chez la drosophile développement trachéale. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour analyser la fonction des gènes d'autres tissus et le développement d'organes.
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier équipages Stephen dysfusion ADNc, des anticorps Dys et w mouches 1118.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Huile halocarbonée 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Pompe picolitre Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microchargeurs | Eppendorf | 930001007 |
Références
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
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Réimpressions et autorisations
