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1. Insectes
- Nombril orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) colonie dans notre laboratoire proviennent de mites recueillies auprès des amandiers à Fresno, en Californie. Notre colonie d'insectes est maintenue dans l'environnement des chambres (Percival Inc, IA) à 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% d'humidité relative, et sous 16h08 h (lumière: obscurité) photo régime.
- Mites émergents sont collectées quotidiennement, sexué, et transféré à des boîtes en plastique (669 ml boîte à lunch, 13 x 13 cm, hauteur, 4,5 cm, Rubbermaid) fourni avec jusqu'à 10 couches de serviettes papier imbibé d'eau (Thirsty ultra absorbants, 27,9 x 27,9 cm ; Safeway). Couvre Box sont perforés pour permettre la circulation de l'air. Cet arrangement permet ~ 100% HR.
- Pour des mesures électrophysiologiques nous utilisons 2-4 jours après l'émergence des papillons anciens, qui sont maintenus sous une forte humidité.
2. Préparation électrophysiologiques
- Mites (mâles ou femelles) sont doucement poussé dans une pipette (200 uL, USA Scientific Inc) qui est coupé par le haut pour avoir un diamètre de l'extrémité de grande taille (environ 2 mm). Un papillon de nuit est doucement poussé par l'autre bout avec un talon de papiers tissu humidifié jusqu'au antennes et une partie de la tête dépasser de l'extrémité.
- Tête exposée est immobilisé en couvrant la tête avec de l'argile non-séchage (Claytoon, Van Aken international, CA) en laissant une petite partie d'un œil et deux antennes exposés. Cette préparation est placée sur une plate-forme de l'EAG Micromanipulateur MP-12 (Syntech, Allemagne) entre les deux porte-électrodes.
- Nous utilisons électrode en verre fabriqués à partir de 1,0 mm tube capillaire en borosilicate avec filament (WPI Inc, FL) et a tiré dans un modèle P-97 micropipette extracteur (Sutter Instruments, CA) pour obtenir des microélectrodes de moins d'un micromètre de pointe. Les électrodes sont de retour rempli sensillum lymphatiques sonnerie (Kaissling et Thorson, 1980). Une électrode empale la surface exposée de l'oeil sous le microscope (Leica MZ75) et sert de référence, tandis que l'électrode d'enregistrement accueille les deux antennes. Afin de faciliter le contact, distale 1-2 segments antennaires sont coupés avant d'être inséré dans l'électrode d'enregistrement. Pour les signaux à partir des enregistrements individuels sensilles, nous avons légèrement modifier cette configuration dans laquelle l'électrode d'enregistrement est empalée sous le microscope (Olympus BX51WI; 800x de grossissement). Les potentiels d'action sont enregistrés en insérant l'électrode de verre à la base d'un sensillum. Les signaux sont amplifiés par une haute impédance de pré-amplificateur (Syntech, Allemagne) et introduit dans une UB-IDAC être analysées hors ligne avec AUTOSPIKE logiciel (Syntech, Allemagne). Signaux AC sont filtrés passe-bande entre 100 -10 000 Hz et les potentiels d'action sont extraits par ordinateur en utilisant un algorithme AUTOSPIKE qui distingue leur pic à creux amplitudes du bruit. Les réponses des neurones individuels sont calculés comme l'augmentation (ou diminution) de la fréquence des potentiels d'action (impulsions par seconde) sur la fréquence spontanée.
3. Stimuli chimiques et le protocole de stimulation
- Produits chimiques de haute pureté sont utilisés. Un des principaux constituants du mélange de phéromones femelles de la orangeworm nombril, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal a été obtenu à partir de Bedoukian Research Inc, CT. Les produits chimiques sont dilués, p / v, avec du verre-hexane distillé pour faire le point sur les solutions dilutions pg / pl et 10 décimal sont faites. Une aliquote (10 pi) d'un produit chimique de relance dissous dans l'hexane est chargé sur une bande de papier filtre Whatman (8x40 mm), le solvant est évaporé en agitant pendant 10 s sous une hotte et la bande est placée dans un polypropylène 5 ml seringue (seringues BD, NJ) à partir de laquelle les différents volumes sont éjectés. Hexane seul et une seringue vide servir de témoin.
- La préparation se déroule dans un flux d'air humidifié délivré par le contrôleur de stimulation Syntech (CS-55 modèle; Syntech, Allemagne) à 20 ml / sec à laquelle une impulsion de stimulation de 4 mL / s est ajouté pendant 500 ms. Les signaux sont enregistrés pendant 10 s, 2 s de départ avant le début de l'impulsion de stimulation. Préparation antennaire est stimulé avec 500 ms d'impulsion au cours de laquelle ca. 2 ml de l'air purifié à partir d'une seringue en polypropylène 5 ml contenant le stimulus est ajouté sur le flux d'air principal. Un écart d'au moins 1 min ou plus, suivant les réponses de haut, est autorisé entre les stimulations.
4. Les résultats représentatifs
Antennes de papillons retenue (figure 1) stimulées par composante phéromone femelle, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal générer des réponses à la dose dépendante robustes (figure 2). Cette composante majeure de phéromone suscite également dose-dépendante les réponses excitatrices à long trochoïdes sensilles (figure 3A) tel qu'il apparaît dans les traces d'enregistrements unitaires (figure 3B).
Figure 1. Live nombril papillon orangeworm sobre et exposé de l'antenne
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Figure 2. Réponses à la dose dépendante EAG a suscité en réponse à (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, un constituant majeur des phéromones femelles.
Figure 3. Trichoid Sensilles chez le mâle nombril papillon orangeworm répondre à (Z, Z) -11,13-hexadecadienal de façon dose dépendante. (A) Antenne du mâle nombril orangeworm papillon est multi-segmenté et chaque segment est orné d'un grand nombre de cheveux comme des structures, des sensilles. Un microscope électronique à balayage, montrant les détails dans l'encart (barres d'échelle sont de 200 et 50 uM, respectivement). (B) extracellulaire unitaire des enregistrements à partir d'un sensillum trichoid.