Méthode d'insertion de levure Colony

Summary

Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.

Abstract

Modélisation des différents types de cellules dans des embryons est un mécanisme clé dans le développement des métazoaires. Communautés de microorganismes, comme les colonies et les biofilms également afficher les modèles de types cellulaires. Par exemple, dans la levure S. cerevisiae, les cellules et les cellules sporulées pseudohyphal ne sont pas réparties uniformément dans les colonies. L'importance fonctionnelle de la structuration et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces tendances sont encore mal compris.

Un défi à l'égard de schémas de enquêter types de cellules dans les colonies fongiques, c'est que contrairement au tissu métazoaires, les cellules en colonies sont relativement faiblement attaché à un autre. En particulier, colonies de champignons ne contiennent pas le même niveau complète de la matrice extracellulaire dans la plupart des tissus. Nous rapportons ici une méthode pour intégrer et de sectionnement des colonies de levures qui révèle les habitudes intérieures de types de cellules dans ces colonies. La méthode peut être utilisée pour préparer des coupes épaisses (0,5 μ) utiles pour la microscopie optique et lames minces (0,1 μ) adapté à la microscopie électronique à transmission. Cellules asques et pseudohyphal peuvent être facilement distingués des cellules de levure ovoïde par microscopie optique, tandis que la structure intérieure de ces cellules peuvent être visualisées par EM.

La méthode est basée sur les colonies environnantes avec de l'agar, les infiltrer avec des moyennes de Spurr, puis sectionner. Colonies avec un diamètre de l'ordre de 1-2 mm sont adaptés à ce protocole. En plus de visualiser l'intérieur des colonies, la méthode permet la visualisation de la région de la colonie qui envahit la gélose sous-jacente.

Protocol

1. Isolement des colonies et de fixation

1. Incuber 300 colonies sur milieu gélosé pendant le temps indiqué (une colonie isolée devrait être de 1-2 mm de diamètre).
2. Retirez la colonie (face) et moyennes sous-jacentes à l'aide d'une spatule étroite.
3. Placez quelques gouttes d'agar à 2% 42 ° C sur une lame de microscope en utilisant 1 ml Pipetman pointe et la colonie place immédiatement sur le visage d'agar-vous avant qu'il se solidifie.
4. Placez quelques gouttes d'agar à 2% 42 ° C sur la colonie et laisser se solidifier.
5. Portez des gants pour toutes les étapes jusqu'à la fin de ce protocole
6. Bloc de Trim avec lame ....

Discussion

La méthode présentée révèle les structures internes des colonies. Parce que la méthode est efficace pour déterminer les schémas de types de cellule dans une plage de S. souches cerevisiae avec des morphologies différentes colonies, et aussi dans une espèce apparentée S. paradoxus ^5, la méthode est également susceptible de travailler sur un large éventail de champignons et autres micro-organismes.

Une étape cruciale pour le succès de la méthode est de s'assure.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tétroxyde d’osmium	Microscopie électronique Sciences	RT 19152
Moules d’enrobage en silicone	Fisher Scientific	NC 9975029
Résine époxyde cycloaliphatique	Microscopie électronique Sciences	RT 15004	ERL 4221
Résine époxy	Microscopie électronique Sciences	RT 13000	DER 736
Anhydride	nonénylsucciniqueMicroscopie électronique Sciences	RT 19050	NSA
2-Diméthyl amin– ; thanol	Microscopie électronique Sciences	RT 13300	DMAE
Supports de montage	KPL Inc	71-00-16
Roue tournante	Ted Pella, Inc.	Microtome Pelco 1055
	Leica Microsystems	Ultracut S