Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens</em

Résumé

Une méthode simple et efficace pour transformer Pantens Physcomitrella Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de Physocmitrella Protonemal protoplastes et Arabidopsis Transformation de protoplastes de mésophylle ¹.

Protocole

1. Rendre les protoplastes

1. Ajouter 9 ml de 8% de mannitol à une boîte de Pétri.
2. Avec une spatule, mis 7 jours vieille mousse 2-3 PPNH4 plaques de 5 - dans la boîte de Pétri contenant du mannitol.
3. Ajouter 3 ml de Driselase 2% (Sigma D9515-25G) pour la boîte de Pétri.
4. Incuber les boîtes de Pétri à température ambiante avec agitation douce pendant 1 heure.
5. Filtrer la suspension de protoplastes à travers une maille 100 um (BD Falcon 352 350).
6. Spin filtré la suspension à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant.
7. Re-suspendre les protoplastes très doucement avec 500 uL de mannitol 8%.
8. Ajouter 9,5 ml de mannitol 8% dans le tube de culture. Assurez-vous que les protoplastes sont entièrement suspendus.
9. Répétez la filtration et la remise en suspension des mesures (1.6, 1.7 et 1.8) deux fois plus.
10. Prenez 10 ul de la solution de protoplastes et de compter les protoplastes dans un hématimètre.
11. Multiplier le nombre de protoplastes dans une zone de 16 carrés par 10 000 pour obtenir le nombre de protoplastes par ml (voir figure 1).

2. Transformation

1. Faites tourner la suspension de protoplastes à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant.
2. Re-suspendre protoplastes dans une solution de MMG à la concentration de 1,6 million de protoplastes / mL.
3. Incuber la suspension de protoplastes à température ambiante pendant 20 minutes.
4. Ajouter 600 uL de suspension de protoplastes dans un tube de culture contenant 60 ug d'ADN. Agiter le tube doucement.
5. Ajouter 700 ul de PEG / Ca solution dans le mélange de protoplastes / ADN. Agiter le tube doucement jusqu'à ce mélange est homogène.
6. Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes.
7. Pendant cette période d'attente, la couverture PRM-B assiettes avec du cellophane (80 mm de diamètre des cercles, AA Packaging Limited, UK); permettent d'hydrater la cellophane sur la surface de la plaque pendant au moins 5 min.
8. Avec une spatule, retirer les bulles d'air piégées entre la cellophane et de la plaque.
9. Diluer le mélange avec 3 ml de solution de W5.
10. Spin le mélange à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant.
11. Re-suspendre protoplastes dans fondu 2 mL de PRM-T (avant de l'ajouter aux protoplastes cette solution peut être maintenu liquide à 42 ° C). Planche 1 mL de remettre en suspension protoplastes par PRM-B plaque recouverte par du cellophane. Envelopper les plaques avec Micropore (3M, les soins de santé). Garder les assiettes à 25 ° C dans une chambre de croissance.
12. Alternativement, des protoplastes peuvent être remis en suspension dans 1 ml de milieu liquide et placage plaqué de 0,5 mL sur une plaque PRM-B recouverte de cellophane. Ceci permet une régénération plus rapide, mais le nombre de régénération des plantes est plus faible.
13. Chambre de croissance est fixé pour un h 16. lumière et 8 heures. cycle de sombre.
14. Déplacer le cellophane sur une assiette nouvelle sélection 4 jours après la transformation.

3. Les résultats représentatifs:

Un exemple de transformation est montré dans la figure 2. L'ADN utilisé dans cet exemple était de 7,8 kb superenroulé plasmide portant une cassette résistante hygromycine. Le montant de protoplastes plaqués a été réduit à 50% pour la photographie. Les photos ont été prise deux semaines après que les plantes ont été déplacés vers les plaques de sélection. L'efficacité de transformation n'est pas affectée par la concentration d'ADN jusqu'à 60 pg. Des concentrations plus élevées de l'ADN sont préjudiciables à l'efficacité de transformation. Les données ont montré que cette méthode offre des résultats cohérents sur une large gamme de quantités d'ADN. Cette méthode peut également générer des transformants stables de manière efficace comme le montre le tableau 1, nous pouvons obtenir environ 4 transformants stables par microgramme d'ADN linéarisé, qui est beaucoup plus élevé que ce qui a été indiqué précédemment ^14.

Nous avons également testé l'effet du choc thermique sur l'efficacité de transformation en transformant un plasmide superenroulé transportant un gène d'une protéine fluorescente comme un marqueur. Le choc thermique a été effectué 10 minutes après l'incubation température ambiante (dans l'étape 2.6), en incubant le mélange dans un bain d'eau à 45 ° C pendant 3 minutes. Le mélange a été incubé dans un bain d'eau à température ambiante immédiatement après choc thermique pendant 17 min. Les résultats ont été enregistrés 22 heures après la transformation. Les ratios des transformants obtenus avec et sans choc thermique étaient très similaires (~ 25%), mais nous avons observé un effet négatif du choc thermique sur la viabilité des protoplastes (données non présentées).

Figure 1. Vue de protoplastes dans hémocytomètre. La section nécessaire pour le comptage des protoplastes est indiquée par un carré rouge. Notez les 16 carrés nécessaires pour le comptage des protoplastes (voir 1.11), l'image montre un décompte de 24 protoplastes (240 000 cellules / mL).

Figure 2. Photos de 18 jours anciens transformants transitoires. Protoplastes ont été transformé avec le montant indiqué de plasmide superenroulé. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.

Montant de l'ADN (pg)	Efficacité (tranformants / ug d'ADN)
15, plasmide superenroulé	120 ± 24
30, plasmide superenroulé	145 ± 54
60, plasmide superenroulé	121 ± 60
120, plasmide superenroulé	71 ± 38
60, plasmide linéarisé	4 ± 1

Efficacité de transformation tableau 1. ADN à des montants différents.

Discussion

La méthode présentée ici permet une transformation de l'ADN simple et cohérente dans des protoplastes Physcomitrella patens. Cette méthode a été initialement développé pour ^une Arabidopsis, mais ici nous avons démontré qu'il se comporte bien avec des protoplastes de Physcomitrella patens, une plante simple et différent. Par conséquent, cette méthode peut être appliquée à d'autres espèces végétales avec des modifications mineures. Modifications possibles pour l'optimisation incluent la concentration de protoplastes MMG, le temps d'incubation dans une solution de MMG et PEG / Ca. Nous avons choisi d'utiliser 60 ug d'ADN dans nos expériences de routine parce que le nombre de transformants augmente linéairement avec la concentration d'ADN jusqu'à ce point (tableau 1). Nous pourrions obtenir environ 7000 transformants transitoires ou 200 transformants stables sur une seule transformation de 60 ug d'ADN, qui permet de dépistage et d'analyse d'une grande population de plantes.

Les protoplastes transformés peuvent être réparties en milieu d'étalement de liquide ou PRM-T. Bien que l'efficacité de la régénération est plus faible lorsque milieu d'étalement liquide est utilisé, nous avons choisi cette méthode lorsque les protoplastes ont été transformées avec les plasmides superenroulé. Comme montré dans le tableau 1, les transformations fait avec l'ADN plasmidique superenroulé générer des transformants beaucoup plus et donc, nous pouvons encore obtenir un grand nombre de plantes avec des moyennes plaquage liquide. Par ailleurs, la propagation protoplastes avec milieu d'étalement liquide permet une régénération plus rapide, ce qui est important pour les expériences impliquant des phénotypes transitoires, telles que RNAi renverser expériences ^9,15. En plus de l'absence de top agar permet d'isoler des plantes faciles pour immunomarquage et RT-PCR ^9,15.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Ingrédient
PPNH 4	1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 tartrate de diammonium mM 54 uM FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 uM 3 H 3 BO 1,97 uM MnCl2 0,4 H 2 O 0,23 uM 2 .6 H 2 O CoCl 0,19 uM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 uM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 uM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0.168 KI uM Ajouter agar 0,7% pour un milieu solide.
PRM-B	PPNH 4 avec le mannitol 6% et 0,8% d'agar. Ajouter 10 ml de CaCl 2 1M à 1 L avant de couler les plaques.
PRM-T	PPNH 4 avec le mannitol 6% et 0,6% d'agar. Ajouter 0,5 ml de CaCl 2 1M à 50 mL avant l'utilisation.
Milieu d'étalement liquide	PPNH 4 avec le mannitol 8,5% sans agar. Ajouter 0,5 ml de CaCl 2 1M à 50 mL avant l'utilisation.
Driselase 2%	Ajouter 4 g de Driselase (Sigma D9515-25G) à 200 ml de mannitol à 8%. Remuer doucement pendant 30 min. à température ambiante, incuber 30 min. à 4 ° C, et remuer doucement pendant 5 min. à température ambiante. Spin 2500 g pendant 10 min, jeter à granulés. Filtre avec 0,22 um, et de stocker gelés aliquotes de 10 ml. Dégel dans un bain d'eau à température ambiante avant utilisation.
MMG	0,4 M mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM de MES (pH 5,7)
PEG / Ca	4 g PEG4000 3 ml H 2 O 2,5 ml à 0,8 M mannitol 1 ml de CaCl 2 1M
W5	154 mM de NaCl 125 mM de CaCl2 5 mM de KCl 2 mM de MES (pH 5,7)