L'utilisation de systèmes microvolume NanoDrop comme des alternatives concrètes et efficaces pour méthode traditionnelle d'acide nucléiques quantification est décrite à travers la démonstration de deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acides.
Article de méthode
NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dosages biomoléculaire sont continuellement développés qui utilisent des quantités progressivement plus petites de matériel, souvent obstacle à l'utilisation de la cuvette conventionnelle basée sur des instruments de quantification d'acides nucléiques pour ceux qui peuvent effectuer une quantification microvolume.
Le système de rétention NanoDrop microvolume échantillon (Produits Thermo Scientific NanoDrop) en combinant les fonctions technologie des fibres optiques et les propriétés naturelles tension de surface pour capturer et retenir des quantités infimes d'échantillon indépendant de l'appareil de confinement traditionnels tels que les cuvettes ou capillaires. Par ailleurs, le système utilise la longueur des trajets plus courts, ce qui résulte dans une large gamme de mesures de concentration d'acide nucléiques, éliminant la nécessité d'effectuer des dilutions. Réduire le volume d'échantillon requis pour l'analyse spectroscopique facilite également l'inclusion d'autres étapes de contrôle qualité tout au long de nombreux flux moléculaire, augmentant l'efficacité et conduisant finalement à une plus grande confiance dans les résultats en aval.
La nécessité d'une haute sensibilité d'analyse de fluorescence de masse limitée est également apparu avec les récentes avancées expérimentales. Utilisant la même technologie microvolume de rétention de l'échantillon, les mesures de fluorescence peut être réalisée avec 2 pi de matériel, permettant des dosages fluorescents exigences de volume pour être sensiblement réduits. Ces microréactions de 10 uL ou moins sont désormais possibles en utilisant une fluorospectrometer dédié microvolume.
Deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acide sera démontré que l'utilisation de systèmes intégrés de conservation de l'échantillon comme des alternatives aux pratiques traditionnelles cuvette des protocoles. D'abord, une méthode directe A260 d'absorbance avec un spectrophotomètre microvolume est décrite. Elle est suivie par une démonstration d'une méthode de fluorescence qui permet aux volumes réduits réactions de fluorescence avec un fluorospectrometer microvolume. Ces nouvelles techniques permettent l'évaluation des concentrations d'acides nucléiques allant de 1 pg / uL à 15.000 ng / uL avec une consommation minimale de l'échantillon.
Protocole
1. Quantification microvolume acide nucléique en utilisant une NanoDrop 2000c Spectrophotomètre
- Pour commencer, nettoyer les surfaces supérieures et inférieures optique du système de rétention spectrophotomètre microvolume échantillon par pipetage 2 à 3 uL d'eau déminéralisée propre sur la surface inférieure optique.
- Fermer le bras de levier, assurant que le piédestal supérieure vient en contact avec l'eau déminéralisée. Soulever le bras de levier et essuyez les surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer.
- Ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l'application des acides nucléiques. Utiliser un petit volume, pipette calibrée pour effectuer un essai à blanc en supprimant 1 ul de tampon sur la surface inférieure optique. Abaissez le bras de levier et sélectionnez "vierge" dans l'application des acides nucléiques.
- Une fois l'essai à blanc est terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer.
- Choisissez la constante appropriée de l'échantillon qui doit être mesuré.
Tableau 1. Typiques nucléiques gammes de concentration d'acide pour les mesures d'absorbance A280 directe en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop microvolume, une cuvette traditionnelle basée spectrophotomètre utilisé avec une cuvette TrayCell Microcell, et un fluorospectrometer NanoDrop microvolume en conjonction avec le dosage PicoGreen.Type d'échantillon Sélectionnez l'option Constante utilisée pour calculer la concentration ADNdb DNA-50 50 ADNss DNA-33 33 ARN ARN-40 40 Oligo Personnalisé 15-150 - Répartir 1 ul d'échantillon d'acides nucléiques sur la partie inférieure piédestal optique et fermer le bras de levier. Parce que la mesure est indépendant du volume, l'échantillon a seulement besoin de combler le fossé entre les deux surfaces optiques pour une mesure à prendre.
- Sélectionnez "mesure" dans le logiciel d'application. Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d'acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l'échantillon, l'examen de la sortie spectrale.
- Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d'acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l'échantillon, l'examen de l'image spectrale pour évaluer la qualité de l'échantillon.
- Un échantillon d'acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique.
Figure 1. Un échantillon d'acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. - Les sources communes de polluants associés à des techniques d'isolement nucléiques acides comprennent l'extraction phénol / Trizol et la colonne. Dans le cas de l'extraction phénol / Trizol, la contamination réactif résiduel peut être indiquée par des spectres anormaux entre 220 à 240 nm ainsi que par des changements dans la région 260-280 nm. Inversement, la guanidine résiduelles provenant de l'extraction de colonne peut contribuer à un pic de près de 230 nm et un changement dans le creux de 230 nm à environ 240 nm.
Figure 2. Les changements dans les pics et les creux des échantillons B et C par rapport à l'échantillon A d'illustrer comment les contaminants peuvent affecter les spectres des échantillons d'acide nucléique. - Pour évaluer avec précision la qualité des échantillons, 260/280 ou 260/230 ratios doivent être analysés en combinaison avec la qualité spectrale globale. Pur acides nucléiques généralement un ratio de rendement des 260/280 ~ 1,8 et un ratio de 260/280 de ~ 2.0 pour l'ADN et l'ARN, respectivement. Ce ratio est dépendant du pH et la force ionique du tampon utilisé pour faire l'ébauche et les mesures d'échantillons. Des solutions acides seront sous-représenter le ratio de 0,2-0,3, tandis qu'une solution de base sera sur-représenter le ratio de 0,2-0,3. Ratios significativement différents de pureté peut indiquer la présence de protéines, de contaminants de phénol ou d'autres qui absorbent fortement à ou près 280 nm. Le ratio 260/230 pureté est une deuxième mesure de pureté de l'ADN avec des valeurs pour un acide nucléique «pure» couramment de l'ordre de 1.8 à 2.2. Ratios de pureté qui sont nettement inférieurs aux valeurs attendues peuvent indiquer la technique d'isolement utilisées peuvent nécessiter une optimisation plus poussée.
- Spectrophotomètres NanoDrop peut également être utilisé pour quantifier les protéines à l'aide d'absorbance directe ou par des analyses de protéines colorimétrique. Pour assurer la formation adéquate et une reproductibilité de colonne, 2-ul échantillons sont conseillés pour les échantillons de protéines. Se référer à la vidéo suivante JoVE: Détermination microvolume concentration de protéines utilisant le spectrophotomètre NanoDrop https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610
- Pour démontrer à haute sensibilité quantification microvolume acide nucléique en utilisant les 3300 NanoDrop, un kit PicoGreen fluorescence est utilisée. Pour commencer, à équilibrer le kit normes et tous les échantillons d'acides nucléiques à température ambiante. Échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doit être conservé dans l'ambre ou des tubes enveloppés aluminium.
- Préparez assez 1x tampon TE pour toutes les normes et les échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution PicoGreen travail qui sera nécessaire. Préparer un tampon 1xTE en diluant le tampon TE 20x fourni avec une eau sans nucléase par le protocole du fabricant. Volumes de réaction peut varier de 200 uL d'aussi peu que 10 ul. Dans cet exemple, 10 volumes de réaction uL sera préparé.
- Préparer dilués en série de normes ADNdb à 2x la concentration finale souhaitée sans nucléase flacons ou des tubes. Transférer 5 ul de chacune des normes ADNdb dilué dans un individu étiqueté sans nucléase ambre ou de papier d'aluminium couverte tube.
- Aliquote de 5 ul de chaque échantillon ADNdb d'intérêt dans dûment étiquetés sans nucléase ambre ou de papier d'aluminium recouvert tubes.
- Préparer la solution PicoGreen de travail selon le protocole du fabricant. Transfert d'un volume égal de la solution PicoGreen de travail dans chaque tube contenant soit une norme ou un échantillon d'intérêt (5 uL dans cet exemple).
- Combiner des volumes égaux de 1x tampon TE et PicoGreen solution de travail pour préparer le contrôle négatif, qui sert de solution de référence.
- Mélanger le contenu de chaque tube de réaction à fond par pipetage doux et incuber les réactions à la température ambiante pendant 5 minutes. Toutes les normes et les échantillons doivent être équilibrées à la même température avant la mesure en tant que signal de fluorescence est affectée par la température.
- Pour préparer l'instrument et effectuer des mesures, d'abord nettoyer les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l'échantillon. Pipeter 2 à 3 uL d'eau déminéralisée sur la surface inférieure d'optique, à proximité, puis ouvrez le bras de levier, et éponger les piédestaux supérieure et inférieure avec un chiffon propre, non pelucheux, essuyez laboratoire. Assurez-vous que les surfaces sont libres de charpie avant de procéder comme charpie peuvent présenter fluorescence en présence d'une source d'excitation et peut interférer avec la mesure.
- Ouvrez le logiciel de l'instrument, sélectionnez l'option "Nucleic Acids" application, et sélectionnez l'option "PicoGreen-ADNdb" option.
- Pour l'instrument vierge, ajouter 2 ul de TE 1x à la baisse piédestal, fermer le bras, et sélectionnez "vierge" dans le domaine logiciel de l'instrument. Une fois vide est complet, éponger hors de la solution à blanc par les deux surfaces du système de rétention de l'échantillon.
- Mélanger la solution de référence par pipetage doux. En utilisant des pointes faible rétention, pipette 2 uL sur la partie inférieure piédestal et fermer le bras.
- Sélectionnez "référence" dans le type de mesure, et de sélectionner les unités désirées. Cliquez sur "Mesure" pour lancer le cycle de mesure.
- Lorsque le cycle de mesure est terminée, ouvrez le bras et à fond blot sur les surfaces de l'échantillon de rétention du système. Mesure jusqu'à cinq répétitions de la référence, en utilisant une aliquote fraîche pour chaque réplique.
- Répétez le processus pour les normes supplémentaires pour construire une courbe standard. Jusqu'à sept normes peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu'à cinq répétitions pour chaque norme. Réplique des normes sont en moyenne de générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations de l'échantillon sont déterminés automatiquement.
- Une fois la courbe standard est complète, sélectionnez l'option "échantillons" onglet, entrez les informations de l'échantillon respectifs ID et de mesurer chaque échantillon inconnu.
Discussion
Les protocoles de quantification présentées ici sont basées sur les systèmes les plus largement acceptées microvolume. Ces systèmes fournissent des solutions de rechange pratique pour méthode traditionnelle d'acide nucléiques quantification, qui reposent sur des volumes d'échantillon plus grande et l'utilisation d'appareils de confinement.
NanoDrop microvolume technologie utilise un système de rétention d'échantillon qui s'appuie sur les propriétés de tension superficielle de l'échantillon mesuré pour former une colonne liquide. Il est essentiel que l'échantillon est en contact avec les surfaces supérieures et inférieures de mesure optique pour la formation de la colonne appropriée. Si à tout moment les résultats de mesure semblent inexactes ou non reproductibles, il est probablement le résultat de l'hétérogénéité de l'échantillon ou le bris de colonne liquide.
Détergents et d'alcool isopropylique ne sont pas recommandés agents de nettoyage, car ils peuvent incondition les surfaces de mesure piédestal. Un piédestal inconditionnée se produit lorsque les propriétés de surface hydrophobe du piédestal a été compromise, ce qui entraîne un aplatissement de la goutte d'échantillon. Socles Inconditionné peut conduire à la rupture de la colonne de liquide pendant le mesurage.
Surface de la figure 3. Inconditionné est caractérisée par un aplatissement d'une goutte d'eau.
Surfaces piédestal Uncondtioned peut être reconditionné en utilisant le composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1, Thermo Scientific Products NanoDrop). Une fine couche de composé reconditionnement est appliqué sur les surfaces supérieures et inférieures piédestal, on laisse sécher pendant environ 30 secondes, puis déteint l'aide d'un endroit propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. Un état avec succès reconditionnés est caractérisée par une gouttelette d'eau perlant place lorsqu'il est appliqué à la surface piédestal bas.
Figure 4. Une surface reconditionnés est caractérisée par un perlage d'une goutte d'eau.
Systèmes de quantification microvolume réduire considérablement la consommation de l'échantillon et augmenter considérablement la gamme de concentration par rapport aux systèmes quantification plus traditionnels. Bien que la quantification microvolume est souvent devenu une technologie habilitante pour des circonstances impliquant la masse cellulaire limitée tels que biopsies à l'aiguille et le laser capture microdissection, l'efficacité et la facilité d'utilisation de cette méthodologie a fait largement accepté alternative aux méthodes de quantification d'acides nucléiques, même lorsque l'échantillon est abondante.
Déclarations de divulgation
Philippe Desjardins et Debra Conklin sont employés par des produits Thermo Scientific NanoDrop, Inc qui produit des instruments utilisés dans cet article.
Remerciements
Richard W. Beringer et David L. Ash, scientifiques applications, produits Thermo Scientific NanoDrop, d'assistance technique et de tournage.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-2000C | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Références
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
- Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. , Munich, Germany. (2006).
- Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
- Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).
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