Western blot en utilisant l'Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Résumé

Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l'électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d'Invitrogen.

Résumé

Western Blot (ou immuno-) est une procédure standard de laboratoire permettant aux enquêteurs de vérifier l'expression d'une protéine, de déterminer la quantité relative de la protéine présente dans les différents échantillons, et d'analyser les résultats des expériences de co-immunoprécipitation. Dans cette méthode, une protéine cible est détectée avec un anticorps primaire spécifique dans un échantillon donné d'homogénat de tissu ou de l'extrait. Séparation des protéines selon leur poids moléculaire est réalisé en utilisant dénaturant SDS-PAGE. Après transfert sur une membrane, la protéine cible est sondée avec un anticorps spécifique primaire et détecté par chimioluminescence.

Depuis sa première description, la technique de western-blot a subi plusieurs améliorations, dont préfabriqués gels et conviviale de l'équipement. Dans notre laboratoire, nous avons choisi d'utiliser le système NuPAGE commercialement disponible chez Invitrogen électrophorèse. Il s'agit d'un pH neutre, innovant, discontinue SDS-PAGE, préfabriqués mini-système de gel. Ce système présente plusieurs avantages par rapport à la technique traditionnelle de Laemmli notamment: i) une durée de conservation des gels préfabriqués allant de 8 mois à 1 an; ii) une gamme de séparation éventail de poids moléculaires de 1 à 400 kDa selon le type du gel utilisé, et iii) une plus grande polyvalence (gamme de pourcentage d'acrylamide, le type de gel, et la composition ionique du tampon d'exécution).

La procédure décrite dans cet article la vidéo utilise le système de tampon Bis-Tris discontinue avec 4-12% de Bis-Tris gels de gradient et MES courir tampon, comme une illustration de la façon d'effectuer un test western blot-en utilisant le système d'Invitrogen électrophorèse NuPAGE. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu de bons résultats et reproductible pour diverses applications biochimiques en utilisant cette méthode western-blot.

Protocole

L'électrophorèse sur gel

Note technique: Avant de commencer la procédure, vous avez votre échantillons de protéines prêt.

Durant cette première étape, les protéines de l'échantillon sont séparés selon leur poids moléculaire en utilisant électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE). Le Tampon NuPAGE ® échantillon LDS chargé avec dodécyl sulfate de lithium (LDS) maintient polypeptides dans un état ​​dénaturé fois l'échantillon de protéine a été chauffé à 70 ° C pendant 10 minutes. Un agent réducteur fort est utilisé en conjonction d'e....

Discussion

La procédure présentée ici utilise un gel de Bis-Tris avec MES Tampon comme un exemple de dénaturation PAGE en utilisant le système d'Invitrogen NuPAGE électrophorèse Novex. En outre, ce système de pré-gel permet la séparation des protéines fonte sous dénaturation ou conditions non dénaturantes ainsi que peut accueillir une large gamme de poids moléculaire (1 à 200 kDa pour les gels Bis-Tris à 36-400 kDa pour le Tris- des gels d'acétate). Selon votre expérience, vous pouvez choisir de suivre une partie seulement de la technique de w.......