Cet article détaille la vidéo la procédure expérimentale pour l'obtention du énergie libre de Gibbs du repliement des protéines membranaires par le tryptophane de fluorescence.
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Article de méthode
Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Repliement des protéines membranaires est un sujet émergent ayant une importance fondamentale et liés à la santé. L'abondance des protéines membranaires dans les cellules sous-tend la nécessité d'étude exhaustive sur le pliage de cette famille de protéines ubiquitaires. En outre, les progrès dans notre capacité à caractériser les maladies associées à des protéines mal repliées ont motivé d'importants efforts expérimentaux et théoriques dans le domaine du repliement des protéines. Des progrès rapides dans ce domaine important est malheureusement entravée par les défis inhérents associés à des protéines membranaires et la complexité du mécanisme de pliage. Ici, nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer les propriétés thermodynamiques de l'énergie libre de Gibbs se déroule en l'absence de dénaturant, Δ G ° H 2 O, pour une protéine membranaire intégrale représentant de E. coli. Ce protocole met l'accent sur l'application de la spectroscopie de fluorescence pour déterminer l'équilibre des populations d'états plié et déplié comme une fonction de la concentration de dénaturant. Considérations expérimentales pour la préparation de vésicules lipidiques synthétiques ainsi que des principales étapes de la procédure d'analyse de données sont mis en surbrillance. Cette technique est polyvalente et peut être poursuivie avec différents types de dénaturant, y compris la température et le pH, ainsi que dans divers environnements de pliage des lipides et des micelles. Le protocole actuel est celui qui peut être généralisé à toute membrane ou de protéines solubles qui répond à la série de critères discutés ci-dessous.
Protocole
1. Préparation de ~ 50 nm de diamètre de petites vésicules unilamellaires (SUV) pour Folding des protéines membranaires
- Une solution de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) lipides dans le chloroforme est acheté et aliquotes dans des flacons en verre propre dans 20 mg par flacon pour le stockage de quantités. Une couche de gaz d'azote est ajouté à chaque flacon pour éviter l'oxydation des lipides, et les flacons sont scellés avec des bouchons et de parafilm. Les flacons sont conservés dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Une seule fiole qui contient une aliquote de 20 mg de lipides dans le chloroforme est util....
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Discussion
Le protocole actuel décrit la génération de courbes de déroulement associée à la membrane des protéines et des peptides qui contiennent des résidus tryptophane. Ici, il est supposé que la fluorescence du tryptophane indique si la protéine est pliée et insérée dans les vésicules lipidiques synthétiques, ou dépliée en solution. D'autres hypothèses, telles que les deux état de pliage et de la dépendance linéaire de l'énergie libre avec la concentration de dénaturant, sont faites dans le rapport actuel;. Modificat.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous remercions Pékin Wu pour l'utilisation de ses données. Ce travail a été soutenu par une bourse de carrière NSF JEK
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urée | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Phosphate de potassium dibasique | Fisher Scientific | P288 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Fisher Scientific | P285 |
Références
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U.
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Réimpressions et autorisations
