Immunocytochimie est une méthode puissante pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série d'étapes qui permettent de conserver les anticorps et tirer le meilleur parti de sa coloration.
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Article de méthode
Immunocytochimie: des cellules souches humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Immunocytochimie est une méthode très puissante et assez simple pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt, le plus souvent une protéine, dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série de mesures qui permettront aux chercheurs de conserver les anticorps primaires et secondaires tout en obtenant de haute qualité, reproductibles et qualitative des données quantitatives de leur coloration. Il ya deux aspects de ce protocole qui aidera à conserver le volume d'anticorps nécessaire pour la coloration. D'une part, les cellules sont cultivées sur de petites lamelles circulaires qui sont placés dans les puits d'une plaque de culture de tissus. Après fixation, les cellules sur des lamelles peuvent être retirés dans les puits de la plaque. Pour la coloration des anticorps, la lamelle avec des cellules est inversée sur une petite goutte de solution d'anticorps sur parafilm et est recouvert d'un second morceau de parafilm pour éviter le dessèchement. En utilisant cette méthode, seulement ~ 25 pl de solution d'anticorps est nécessaire pour chaque lamelle (ou échantillons) doivent être colorées. Ce protocole décrit immunomarquage des souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs), mais peut être utilisé pour de nombreux autres types cellulaires.
Protocole
Jour 1: Préparation des lamelles en verre Cellules allemande et l'ensemencement
Remarque: des lamelles de verre allemands sont souvent préférable pour la culture primaire des cellules souches neurales et les neurones. Nous utilisons le protocole de nettoyage suivantes pour améliorer l'adhérence des cellules et se propager. Position des lamelles dans un rack petits qui permettra l'accès de liquide aux deux côtés de la lamelle. Tout d'abord, des lamelles incuber dans Liquinox 1% pendant 10 minutes, suivie de 3 lavages avec de l'eau déminéralisée. Assurez-vous qu'aucun des bulles de savon restent. Ensuite, glis....
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Discussion
Ce protocole décrit une procédure d'immunomarquage hNSPCs qui minimise la quantité d'anticorps nécessaire et donne une coloration cellulaire fiable. La procédure décrite est la meilleure pour les antigènes intracellulaires, mais peut être modifiée pour tache de molécules de surface cellulaire ou à améliorer la coloration du cytosquelette.
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Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l'Hôpital des Enfants, le comté d'Orange Institut de recherche pour fournir des cultures hNSPC et le Dr Gary Bassell à l'Université Emory d'instruction initiale dans la technique de coloration parafilm.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Coverslips en verre allemand (Deutsche Spiegelglas) | Outil | Carolina Biological | WW-63-3029 | Coverslips disponibles en 12, 15, 18, 22, 25 mm |
| Détergent Liquinox sans phosphate | Réactif | Sigma-Aldrich | Z273279 | très visqueux |
| Hydrobromure de poly-D-lysine | Réactif | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminine naturelle de souris | Réactif | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Réactif | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distribué par Fisher sous le numéro de catalogue indiqué |
| Plaque 24 puits | Outil | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Réactif | Fisher Scientific | BP151-500 | très visqueux |
| Paraformaldéhyde | Réactif | Sigma-Aldrich | P6148 | potentiel carcinogène, manipuler avec précaution sous forme de poudre et en solution |
| Albumine sérique de bovin, sans IgG | Réactif | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | Réactif | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Réactif | Vector Laboratories | H-1000 | visqueux |
Références
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S.
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Réimpressions et autorisations
