La pressurisation impulsif de cellules neuronales pour l'étude de lésions cérébrales traumatiques

Résumé

Un roman expérience impulsif pressurisation cellulaire a été développé en utilisant un dispositif bar Kolsky d'étudier les mécanismes moléculaires / cellulaires de haut-induit un traumatisme crânien.

Résumé

Un roman expérience impulsif pressurisation cellulaire a été développé en utilisant un dispositif bar Kolsky d'enquêter explosion provoquée par une lésion cérébrale traumatique (TBI). Nous montrons dans cet article comment la vidéo blast-TCC pertinente pression impulsive est appliquée aux cellules neuronales in vitro. Ceci est réalisé à l'aide d'impulsions de pression bien contrôlée créée par un dispositif Kolsky barreau spécialisé, avec historique de la pression complète dans la chambre de pressurisation cellulaire enregistré. Pression cellules neuronales sont inspectés immédiatement après pressurisation, ou encore incubé à examiner les effets à long terme de pressurisation impulsif sur neurites / axonale excroissance, l'expression des gènes des neurones, l'apoptose, etc Nous avons observé que la pressurisation impulsif à environ 2 MPa induit une perte nette par rapport neurites pour les cellules non pressurisé. Notre technique permet une nouvelle méthode pour étudier les mécanismes moléculaires / cellulaires de souffle TBI, par l'intermédiaire de pressurisation impulsif des cellules du cerveau à bien contrôlée prEssure ampleur et la durée.

Protocole

1. Culture de cellules neuronales

1. Les cellules du cerveau, y compris les cellules neuronales, les astrocytes, et leur co-culture peut être utilisé comme modèle cellulaire. Comme une démonstration de faisabilité, la pressurisation impulsif de lignées cellulaires des cellules neuronales est présenté.
2. SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain (ATCC, CRL-2266) sont cultivées sur des lamelles de verre de 18 mm de diamètre. Les cellules sont ensemencées à une densité de 3 x 10 ³ cellules / cm ^{2 en} utilisant les milieux de croissance composé de DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Diapositives de cellules cultivées en verre sont conservés dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C.
3. Pour obtenir la différenciation des cellules neuronales des cellules SH-SY5Y, les cellules sont traitées avec des médias plus supplémentés avec 10 uM d'acide rétinoïque (RA) pendant 7 jours avec les médias changés tous les deux jours. Au jour 7, les cellules sont prêts à être mis sous pression.

2. Equipement de pressurisation: Kolsky Bar

1. La barre Kolsky, dedéveloppé par Kolsky ¹ en 1949, a été utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques d'un matériau à un taux de charge très élevée. L'appareil est constitué de deux barres avec un échantillon mis en contact entre les barres. Une vague de stress, créé sur la barre incident, se propage à l'échantillon où la vague se divise en une onde réfléchie et transmise. La contrainte dans l'échantillon est proportionnelle à l'onde émise. Dans cette étude, nous utilisons une chambre de pressurisation cellule pour être placé entre les deux barreaux de la Kolsky set-up.
2. Les deux barres en alliage d'aluminium (chacun 6-m de long) sont suspendues par des paliers alignés en laiton, et une chambre de pressurisation vitro de cellules est prise en sandwich entre les barres. La barre est en amont de la barre incident avec une masse £ 130 serré sur une extrémité. Dispositif de serrage à friction est placé dans une position qui donne la durée d'impulsion souhaitée. En engageant la pince de serrage et un vérin ciseaux entre la masse et un support de chargement, la section de serrage de la barre de masse incident est pré-compressed au niveau souhaité. Forcer un verrou qui bloque l'encoche de serrage à une rupture brutale d'un système hydraulique de compression libère le pré-enregistrées rapidement et génère ainsi une impulsion de pression. Cette propage à travers la barre d'incident, entraîne le piston chambre d'essai, et pressurise le fluide et les cellules à l'intérieur de la chambre de manière impulsive. La pressurisation chambre déclenche à son tour une impulsion de pression se propageant dans l'aval de la barre transmissibles. Les souches associées à des impulsions de pression dans les barres sont mesurées composé de haut jauges de contrainte à résistance excités à 45 volts. Les signaux des jauges sont enregistrées avec un oscilloscope numérique à 1 MHz comme une histoire de chargement.
3. Dans la chambre de pressurisation vitro de cellules est constitué d'un piston-cylindre. Le cylindre a 2,6 cm de diamètre intérieur et de 3,8 cm de diamètre externe, et comporte un trou taraudé petite à la base de la cavité. Le trou sert à air et l'excès de liquide lors de l'installation échantillon de cellules. Le piston est de 7,5 cm de longet est fabriqué à partir du matériau même barre. Le piston est enveloppé avec deux à trois couches de (téflon) plombier bande servant de joint d'étanchéité à faible frottement. L'embout est de 32 mm de long et possède deux petites vis en acier inoxydable qui maintiennent les lamelles de verre (sur lequel les cellules sont mises en culture) lors du chargement.

3. La pressurisation impulsif des cellules neuronales

1. Toutes les parties de la chambre de pressurisation sont stérilisés à l'aide de l'autoclave et sont conservées sous une lumière UV. L'ensemble de la chambre est réalisée à l'intérieur de la hotte de culture cellulaire. La vis de purge dans la chambre est plus ou moins engagée dans la prise d'air à la base de la cavité. Préchauffé (37 ° C) milieu de croissance frais est introduit à la pipette dans la chambre sans faire de bulles. Ensuite, une lame de verre cellulaire cultivée est capté, et est placé sur le capuchon du piston (cellules faisant face à l'extérieur). Les petites vis de fixation sont serrées sur la lame pour le maintenir en place. Le piston avec une lame de verre cellulaire cultivée est inséré un petit into la cavité de la chambre, et l'ensemble est incliné par l'évent étant au plus haut point. La vis de purge est éliminé et le piston est poussé dans la cavité de première force sur des bulles d'air, puis l'excès de liquide. Soit une marque de référence ou un gabarit est utilisé comme un guide pour assurer le même volume de support de culture pour chaque essai. La dimension axiale des médias dans la chambre est d'environ 6 mm. Désinfectez la vis de purge et de le remplacer pour rendre l'eau chambre étanche. La chambre ne doit pas fuir sous cette charge statique, si c'est le cas, l'enveloppe en téflon doit être remplacé ou renforcé.
2. À ce stade, le système de barre Kolsky est remis à zéro. La masse lourde est ramené à sa position initiale et un nouveau boulon de verrouillage remplace l'occasion (cassé) une. Engager le nouveau boulon de verrouillage avec le système hydraulique à environ 200 psi. Utilisez le cric ciseaux pour comprimer la section de pré-chargement de la barre de l'incident jusqu'à une pression légèrement supérieure à la valeur désirée, puis la couper pour engager la friction complet de lavis du cric. L'acquisition des données est maintenant armé.
3. La chambre de mise sous pression monté cellule est montée dans le système. Elle est placée dans un bloc de V supporté par petit vérin ciseaux laboratoire et aligné avec les deux barres. Graisser chaque interface avec une couche de graisse légère et frottez les surfaces d'aboutement ensemble pour éliminer les espaces d'air entre les deux.
4. Le test est maintenant prêt à procéder. Le verrou de serrage est contraint de briser rapidement par le conducteur de pompage pince hydraulique. La pince se séparent et l'acquisition des données doit afficher les résultats. L'historique de pressurisation cellule est déterminée à partir des mesures de la jauge de la barre transmis. Si la barre de transmission utilisée est assez longue, cela ne devrait être le premier trouble au point où les mesures montrent une pression négative. La durée de l'impulsion émise peut être plus courte que l'impulsion incidente si une bulle est piégé. L'ampleur ne peut atteindre celle de l'impulsion incidente, mais il doit avoir une lon suffisammentg plateau avant le déchargement. Autrement, supporte une grande bulle d'air dans la chambre étanche ou un défaut d'alignement entre l'ensemble et une barre a pu se produire.
5. La chambre de pressurisation cellule est ensuite retirée et démontée à l'intérieur de la hotte de culture cellulaire. La vis de purge est éliminé et le piston libre est tiré de la chambre. La lame de verre cellulaire cultivée est tiré de l'extrémité du piston.

4. Évaluation du comportement cellulaire sous pression

1. Après pressurisation, les cellules peuvent être inspectés immédiatement ou à terme en incubation pendant un examen ultérieur. Avec la conduite des processus de fonctionnement d'asepsie, à plus long terme de post-incubation est possible.
2. Cellules pressurisées peut être examiné par toutes les techniques de biologie moléculaire et cellulaire. Plus précisément pour la pressurisation des cellules neuronales, pour étudier la physiologie cellulaire et moléculaire dans des conditions TBI, les essais de pression d'évaluer les changements induits dans la croissance des neurites, le changement des microtubules du cytosquelette, EXPRE gène neuronalession, apoptose, etc, peuvent être réalisées. Que des échantillons de cellules, des cellules de contrôle qui sont mises en culture, la même maintenu à l'intérieur de la chambre de pressurisation pour la même période de temps, mais pas sous pression sont utilisés (dite chambre de commande).
3. Permettant d'évaluer les variations de la croissance des neurites, les cellules de commande sous pression et la chambre sont examinées au microscope optique immédiatement après pressurisation et 1 h 24 et de post-incubation. Un exemple d'images de cellules neuronales sont présentés dans la section «Les résultats représentatifs» (Figure 2). La modification de la longueur des neurites peut être quantifiée par l'actine immunofluorescence et analyse d'image. Les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde en poids / volume de 4%, on rince avec un 0,05% v / v de Tween-20 de tampon de lavage, et perméabilisées avec un 0,1% v / v de Triton X-100 solution. Après blocage avec une solution à 1% p / v de sérum-albumine bovine, les cellules sont incubées avec de l'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC)-conjugué phalloïdine. Images par immunofluorescence des cellules sont prélevées à l'aide d'une lampe fluorescentemicroscope et la longueur des neurites des cellules sous pression et de commande sont quantifiés à l'aide du logiciel ImageJ (NIH).
4. Les neurites peuvent être identifiés comme des axones ou dendrites. Pour évaluer les changements morphologiques dans les axones ou dendrites, les expériences décrites ci-dessus peut être répété en utilisant la détection d'anticorps chaque structure, c'est-neurofilaments (NF) anticorps pour les axones et les microtubules associated protein (MAP2) anticorps pour dendrites.
5. Les microtubules sont un des éléments clés du cytosquelette des neurones, et les dommages aux microtubules a été utilisé comme marqueur de lésion neuronale. ² microtubules peuvent être visualisées par immunofluorescence en utilisant l'anticorps β-tubuline. Les cellules sont fixées après 0 h et 24 h de l'après-pressurisation, tachée de β-tubuline, et observé par microscope à fluorescence.
6. Pour évaluer l'effet de la pression impulsive sur l'expression génique neuronale apoptotique et, l'ARN total est extrait des cellules sous pression et de contrôle. Genl'expression e peut être examiné en effectuant RT-PCR quantitative en temps réel ou RT-PCR, semblable à nos protocoles publiés ^3.

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Un exemple de profil de pression appliquée sur les cellules à l'intérieur de la chambre de pressurisation. Le dispositif génère succès barre Kolsky 2 niveau MPa, pression de type mono-impulsion impulsive avec une durée d'environ 0,7 ms.

Figure 2. Un exemple de réponse neuronale à la pressurisation impulsif. SH-SY5Y exposées à la pressurisation impulsif à 2 MPa spectacle distincte des neurites / axone rupture par rapport aux cellules témoins chambre.

6. Difficultés et solutions

1. Chambre d'étanchéité est l'un des principaux obstacles à surmonter. Il est found que les disques larges avec des joints toriques ont un problème de gougeage et une friction accrue. Afin d'éliminer les effets de frottement, ainsi que de prévenir le gougeage, une méthode simple de ruban adhésif piston avec du ruban téflon plombier est utilisé. Cela résout les problèmes et produit le niveau de pression désiré et la durée.
2. Sous pression le comportement des cellules neuronales, en particulier lors de l'évaluation secondaires mécanisme de TBI ou des effets à plus long terme, doivent être examinées après un long temps de post-incubation. La chambre contenant les cellules est exposé à des conditions potentiellement non stérile tout en se déplaçant à la barre Kolsky, de pressurisation, et de revenir à la hotte de culture cellulaire. Avec pré-stérilisation des parties de la chambre et le bon fonctionnement de montage / démontage de la lame culture cellulaire et de la chambre à l'intérieur de la hotte de culture cellulaire, à plus long terme de post-incubation est possible jusqu'à plusieurs semaines.
3. La reproductibilité des données est un paramètre important dans la stimulation cellulaire expériences mécaniques. Pour notre dispositif, la reproducibility en réponse neuronale est déterminé comment le profil souhaité de pressurisation impulsif, du niveau de pression à la fois et la durée, est à plusieurs reprises obtenu. Depuis, nous enregistrons le profil de pression obtenu pour chaque pression, les données de réponse des cellules du profil de pression indésirables peuvent être exclus manuellement par la suite.
4. Les étapes de pressurisation entières, y compris le montage de chambre, de transfert et de monter dans la barre Kolsky, la pressurisation, le transfert de l'arrière, et la chambre de démontage, prendre moins de 10 minutes. La diapositive suivante culture cellulaire peut être mis sous pression immédiatement après la mise sous pression précédente. Ainsi, un nombre suffisant d'expériences de pressurisation peut être complété de manière efficace. Notre set-up utilise des lamelles de 18 mm de diamètre en verre. Une expérience de pressurisation ne fournit pas assez de protéines pour Western blot en raison de la taille du substrat (et aussi parce que certaines des cellules sont mortes sous pression). Environ trois expériences répétées de pressurisation fournir une quantité de protéines nécessaire pour immunoblOtting. Encore une fois, la reproductibilité est vérifiée à chaque fois avec le profil de pression.

Discussion

Beaucoup de techniques expérimentales in vitro ont été tentées pour étudier les dommages aux cellules du cerveau dans des conditions TBI. Il s'agit notamment de neurone / astrocytes étirement, induites par l'écoulement de cisaillement, chute de poids, lacération stylet, laser transection, lithotripsie, etc ^4,5 Il a été supposé que la surpression de courte durée est un facteur dominant pour TBI physiques. Surtout ^6,7 , l'onde de choc de l'explosion TCC a une durée d'impulsion de l'ordre de quelques millisecondes. ^{4 Sur la} base de cette hypothèse et de l'observation, de la chambre baromètre capable de pressurisation transitoire a été mis au point et utilisé pour évaluer le comportement des cellules du cerveau dans des conditions TBI. Par exemple, dans le liquide de la chambre de percussion barotraumatisme une impulsion de pression avec 20-30 ms longue durée et une pression de crête allant jusqu'à 0,5 MPa a été utilisée pour examiner le comportement des cellules gliales humaines dans TBI. ⁶ Récemment, VandeVord et al. ⁷ métal utilisé chambre baromètre frappe de balle d'examiner la astrocytescomportement sous TBI, mais la boule de métal frappant produit des impulsions de pression multiples. Dans cette étude, nous avons développé un dispositif de pressurisation nouvelle cellule qui génère de pressurisation de type mono-impulsion impulsif. L'appareil a été développé sur la base de la barre Kolsky set-up, qui a été utilisé comme un appareil d'essai de matériaux dans nos ⁸ et celle des autres études. ^1,9 bar La capacité Kolsky du matériel de test à taux de charge très élevée a été modifié afin d'être en mesure de appliquer une seule impulsion de surpression de type à des cellules cultivées dans la chambre de mise sous pression (figure 1). Nous pourrions réussir à contrôler l'ampleur et la durée de la surpression impulsif. En tant que représentant de la réponse cellulaire, nous avons démontré que moins 2 MPa de pression cellules SH-SY5Y neuronales afficher des neurites importante et la perte axonale par rapport aux cellules témoins non pressurisées de chambre.

En conclusion, nous avons développé un nouveau dispositif de pressurisation impulsif cellule en utilisant un spécialement conçu Kolskyet un dispositif de barre démontré son utilisation potentielle dans les enquêtes sur la réponse neuronale dans des conditions TBI. Nous notons également que cette technique est très polyvalent en ce que tout type de cellules peuvent être exposées à des pressions impulsives à différents niveaux et la durée. Par conséquent, l'appareil peut être utilisé pour étudier la impulsive induite par la pression mécanotransduction cellulaire comportement, non seulement pour blesser les cellules, mais aussi pour stimuler les cellules positivement dans leur fonction et la détermination du destin.

Matériaux

• SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) cellules de neuroblastome humain
• 18 mm de diamètre lamelles de verre
• Milieux de culture cellulaire: DMEM, 10% de sérum de veau foetal, 1% de pénicilline-streptomycine
• L'acide rétinoïque (10 uM) pour la neurogenèse induisant
• Kolsky bar dispositif de pressurisation impulsif
• Piston-cylindre chambre de pressurisation cellule
• Vis en acier inoxydable pour la fixation lamelle de cellules cultivées sur le piston
• Graisse pour interfaces entre cellules chambre et Kolsky bar
• Fournitures générales de biologie moléculaire pour l'évaluation de la réponse cellulaire à une pressurisation (fixateur, anticorps, colorant fluorescent, fournitures PCR, etc)