Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous décrivons une méthode pour la préparation de leucocytes infiltrant le cerveau (Bils) de souris. Nous démontrons comment infecter des souris avec le virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) via une technique d'injection intracrânienne rapide et comment purifier une population leucocytaire enrichi des cellules infiltrant du cerveau entier. Brièvement, les souris sont anesthésiés à l'isoflurane dans une chambre fermée et sont main-libre injecté avec une seringue Hamilton dans le cortex frontal. Les souris sont ensuite tués à différents moments après l'infection par surdose isoflurane et cerveaux entiers sont extraits et homogénéisé dans du RPMI avec un broyeur de tissus Tenbroeck. Homogénats de cerveaux sont centrifugés à travers un gradient de Percoll à 30% continue d'éliminer les débris cellulaires et d'autres myéline. La suspension cellulaire est alors tendu à 40 um, lavés et centrifugés sur un discontinu de Ficoll-Paque plus dégradé à sélectionner et à purifier les leucocytes. Les leucocytes sont ensuite lavées et resuspendues dans des tampons appropriés pour l'immunophénotypage par cytométrie en flux. La cytométrie en flux révèle une population de cellules immunitaires innées aux stades précoces de l'infection chez les souris C57BL / 6. A 24 heures après l'infection, multiples sous-ensembles de cellules immunitaires sont présentes dans le Bils, avec une population enrichie de Gr1 +, CD11b + et + F4/80 cellules. Par conséquent, cette méthode est utile pour caractériser la réponse immunitaire à une infection aiguë dans le cerveau.
Protocole
1. Injection du virus intracrânienne:
La technique suivante a été modifié et largement utilisée par notre laboratoire et ses collègues. Brièvement, l'injection intracrânienne de souche du Daniel de virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) ou fictive-infection (1, 10) est réalisée sur des souris jeunes (de préférence 5-6 semaines d'âge) pour obtenir des leucocytes infiltrant le cerveau (Bils). S'il vous plaît noter que les résultats diffèrent entre les souches du Daniel, la souche de soja et la souche GDVII. Aux fins de la récolte de Bils, souris reçoivent 2x10 5 UFP de TMEV et sont infectées pendant 24 heures.
- ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous utilisons régulièrement la cytométrie en flux pour déterminer la qualité de la préparation des cellules du cerveau infiltrer, et de distinguer les différentes populations de cellules immunitaires 2, 9. A aiguë du temps des points, notre méthode Bils rendements des pourcentages élevés de monocytes inflammatoires au sein de la population CD45hi ainsi que de forts pourcentages de macrophages dans la population CD45lo. Cela indique que la réponse immunitaire dans reproductibles le cerveau peut être caractéri.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention NS64571 du NINDS (CLH), par une sentence de développement en début de carrière de la Mayo Clinic (CLH), et par un généreux don de Donald et Frances Herdrich (CLH). Nous tenons à remercier la Clinique Mayo de débit de base de cytométrie de l'aide.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs | Société | Le numéro de catalogue | Commentaires |
| TMEV | Howe Lab | N / A | |
| Daniel souche | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| à fond rond tubes Oak Ridge centrifugeuse | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| PBS 10X | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Bleu Trypan 0,4% (p / v) | Mediatech | 25 à 900-CI | |
| 15 ml tubes coniques | BD Falcon | 352097 | |
| 7 ml en verre pyrex marque broyeur de tissus Tenbroeck | Fisher | 08 à 414-10B | |
| 40 tamis cellulaire um | BD Falcon | 352340 | |
| Conique de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| l'albumine sérique bovine | Sigma | A9647 | |
| azide de sodium | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21 à 040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| sérum de veau fœtal | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridomes | ATCC | HB-197 | |
| Costar à fond en V plateau | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifugeuse ou équivalent | Beckman | N / A | |
| 96 puits, seau à la plaque et rotor | Beckman | S2096 | |
| Rotor angulaire | Beckman | F0360 | |
| paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| FlowJo 7.5 | Arbre Star, Inc | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
Références
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
