Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Summary

L'étude décrit une méthode rentable pour l'identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l'eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l'ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.

Abstract

La contamination microbienne de l'environnement représente un risque significatif pour la santé. Classique bactérienne indicateurs fécaux ont montré pour avoir des limites importantes, les virus sont plus résistants aux procédés d'inactivation de nombreux standards et indicateurs fécaux n'informent pas sur la source de contamination. Le développement de méthodes rentables pour la concentration de virus dans l'eau et des dosages moléculaires facilite l'applicabilité de virus comme indicateurs de contamination fécale et en tant que sources de pollution microbienne de suivi (MST) des outils. Les adénovirus sont des virus et des polyomavirus ADN infectant les espèces de vertébrés spécifiques, y compris les humains et sont excrétés dans les selles persistante et / ou d'urine dans toutes les zones géographiques étudiées. Dans des études précédentes, nous avons suggéré la quantification des adénovirus humains (HAdV) et polyomavirus JC (JCPyV) par PCR quantitative (qPCR) comme un indice de contamination fécale humaine. Récemment, nous avons développé des tests qPCR pour la quantification spécifique du poradénovirus ciné (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) comme marqueurs fécaux des animaux de la contamination avec des sensibilités de 10 à 10 copies de génome par tube d'essai. Dans cette étude, nous présentons la procédure à suivre pour identifier la source de contamination dans les échantillons d'eau à l'aide de ces outils. Comme exemple de résultats représentatifs, l'analyse des virus dans les eaux souterraines présentant des niveaux élevés de nitrates est affiché.

Détection des virus à faible ou modérée des eaux polluées requiert de la concentration du virus dans au moins plusieurs litres d'eau dans un volume beaucoup plus petit, une procédure qui comporte généralement deux étapes de concentration en série. Cette procédure un peu lourde et la variabilité observée dans les recouvrements virale entravent de manière significative le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons d'eau.

Afin d'éliminer le goulot d'étranglement causés par les procédures en deux étapes, nous avons appliqué un protocole en une seule étape développé dans Studie précédentes et applicables à une diversité de matrices d'eau. La procédure comprend: l'acidification des échantillons d'eau de dix litres, floculation par du lait écrémé, de la sédimentation par gravité des matériaux floculées, la collecte du précipité et la centrifugation, resuspension du précipité dans un tampon phosphate 10 ml. Le concentré viral est utilisé pour l'extraction d'acides nucléiques viraux et les adénovirus et les polyomavirus spécifiques d'intérêt sont quantifiés par qPCR. Nombre élevé d'échantillons peuvent être analysés simultanément en utilisant cette méthode de concentration à faible coût.

La procédure a été appliquée à l'analyse des eaux de baignade, l'eau de mer et d'eau de la rivière et dans cette étude, nous présentons l'analyse des résultats des échantillons d'eau souterraine. Cette méthode quantitative à haut débit est fiable, simple et rentable.

Protocol

1. La concentration des particules virales présentes dans les échantillons d'eau

1. Collecte et conditionnement des échantillons d'eau
   1. Recueillir un minimum de 2 répétitions de 10 L par échantillon dans des contenants en plastique à fond plat et un échantillon supplémentaire comme un contrôle de processus. Ce dernier échantillon sera dopé avec une quantité connue de particules virales et utilisé comme contrôle.
      Note: Il est recommandé d'avoir du matériel spécial séparé (bouteilles, tubes, etc) pour les échantillons dopés.
   2. Vérifiez l'étalonnage du conductimètre et recalibrer si nécessaire. Préparer un témoin négatif en utilisant l'eau d....

Discussion

La procédure décrite remplirait les conditions pour une méthode d'ajustement de routine des laboratoires de santé publique et d'environnement: reproductible, fiable, simple et rentable. Le protocole est simple, mais elle doit être suivie attentivement. Faible conductivité dans les échantillons sans ajout de la concentration de sels demandé l'eau de mer artificielle réduirait considérablement la récupération des virus comme ce serait le cas si le temps d'agitation pour la floculation est significati.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse à vitesse élevée (8000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-mètre, thermomètre et conductimètre	Afora	LPPC3003
Plastique Longueur des tubes cm 100-200	Deltalab	350059
Stérile pipettes graduées jetables	Labclinics	PN10E1
Stérile tubes en plastique de 1,5 et 10-15 ml (Eppendorf, faucons, etc)	Afora	KA298/00
Des pots à centrifuger (500 ml)	Fisher Scientific	SE5753512
Agitateurs magnétiques et aimants (un parl'échantillon)	Fisher Scientific	10510
Les récipients en verre ou en plastique ayant un fond plat pour permettre l'utilisation d'agitateurs magnétiques	Deltalab	191642
Une pompe péristaltique pour enlever le surnageant (ou une pompe à vide au jet d'eau)	Watson-Marlow	323E / D
Timer pour arrêt de l'agitation après 8-10 heures	Deltalab	900400
L'acide chlorhydrique (1N et 0,1)	Panreac	141020.1611
L'hydroxyde de sodium (1N)	Panreac	131687.1211
Artificial sels de mer eau de mer	Sigma	S9883
Lait écrémé (SM)	Difco	232100
Tampon phosphate pH 7, 5			01:02 v / v de stériles Na 2 HPO 4 0,2 M et NaH 2 PO 4 0,2 M à pH 7,5
Thiosulfate	Panreac	121879.1209	Faire une solution à 10% dans l'eau
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
Plaque de 96 puits de réaction optique (500 unités)	Applied Biosystems	43426659
Optique couvre adhésives (100 unités)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan environnement PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838