Une In vivo Méthode pour tester la fonction des gènes dans le cerveau postnatal est décrite. AAV recombinants exprimant Cre et / ou une protéine fluorescente sont injectées dans le cerveau de souris néonatales. Inactivation d'un gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale sont atteints, permettant une analyse rapide de la fonction des gènes dans les processus essentiels au développement des circuits neuronaux.
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Article de méthode
Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l'aide postnatale à base de virus recombinaison Cre
Dans cet article
Résumé
Résumé
Fonctionnement normal du cerveau repose non seulement sur le développement embryonnaire où les grandes voies neuronales sont établis, mais aussi sur le développement postnatal lorsque les circuits neuronaux sont élevés et raffinée. Le dérèglement à ce stade peut entraîner des troubles neurologiques et psychiatriques comme l'autisme et la schizophrénie 1,2. De nombreux gènes ont été étudiés dans le cerveau prénatal et trouve cruciale pour de nombreux processus développementaux 3-5. Cependant, leur fonction dans le cerveau postnatal est largement inconnu, en partie parce que leur suppression chez la souris conduit souvent à la létalité au cours du développement néonatal, et en partie parce que leur condition en début de développement entrave l'analyse post-natal. Pour surmonter ces obstacles, les allèles floxés de ces gènes sont actuellement générés chez des souris 6. Lorsqu'il est combiné avec des allèles transgéniques qui expriment la recombinase Cre dans des types cellulaires spécifiques, suppression conditionnelle peut être réalisé pour étudier la fonction des gènes dans le cerveau postnatal. Cependant, cette méthode nécessite allèles supplémentaires et du temps supplémentaire (3-6 mois) pour générer des souris avec des génotypes appropriés, limitant ainsi l'expansion de l'analyse génétique à grande échelle dans le cerveau de souris.
Ici nous démontrons une approche complémentaire qui utilise viro-Cre exprimée d'étudier ces allèles floxés rapidement et systématiquement dans le développement du cerveau postnatal. En injectant recombinant virus adéno-associés (rAAVs) 7,8 encodage Cre dans le cerveau néonatal, nous sommes capables de supprimer le gène d'intérêt dans les différentes régions du cerveau. En contrôlant le titre viral et la co-exprimant un marqueur fluorescent protein, nous pouvons atteindre simultanément l'inactivation du gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale. Cette méthode contourne l'exigence de nombreux gènes dans le développement précoce, et nous permet d'étudier leur fonction de cellules autonomes dans de nombreux processus essentiel dans le développement du cerveau postnatal, y compris la croissance axonale et dendritique, de branchement, et le carrelage, ainsi que la formation des synapses et de raffinement. Cette méthode a été utilisée avec succès dans notre propre laboratoire (résultats non publiés) et d'autres 8,9, et peut être étendue à d'autres virus, tels que des lentivirus 9, ainsi que l'expression de shRNA ou dominant des protéines actives 10. Par ailleurs, en combinant cette technique avec l'électrophysiologie ainsi que récemment développé des outils d'imagerie optique 11, cette méthode fournit une nouvelle stratégie pour étudier comment les voies génétiques influencent le développement des circuits neuronaux et la fonction chez les souris et les rats.
Protocole
1. Préparation de l'injection des virus
- rAAVs ont été achetés auprès du fournisseur recommandé commerciaux, mais ils peuvent aussi être produits dans son propre laboratoire (voir la discussion ci-dessous). La solution de virus est généralement produit à un titre de ~ 1x10 12 copies du génome par millilitre (GC / ml) et peut être utilisé à titre complet à manipuler un grand nombre de cellules. Alternativement, ils peuvent être dilués pour obtenir le niveau désiré de l'étiquetage clairsemé. La dilution appropriée doit être déterminée par l'utilisateur, mais une dilution de 1:10 est recommandé de commencer.
- Dégel des virus sur la glace im....
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Discussion
La méthode d'injection néonatale virale présenté ici offre un moyen simple et rapide de générer des mosaïques in vivo pour l'étude du développement du cerveau postnatal. La méthode tire parti des allèles floxés qui sont actuellement disponibles ainsi que ceux qui sont faits par le gène High Throughput ciblage des projets 6. Comparé à l'utilisation de l'expression transgénique de la CRE, cette méthode fournit un moyen rapide de tester la fonction des gènes dans différents type.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail est soutenu par une subvention du NIH RO1 (NINDS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| rAAV8-Cre,-GFP, DsRed-, | Vecteur Biolabs | # 7060, # 7061, afin personnalisée | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | # 702208 | (Pas de port pédale) |
| Rétiniennes kit d'injection épithélium pigmentaire | Instruments de précision du monde | RPE-KIT | Contient conjonctifs aiguilles tuyau d'injection, (36G), et porte-aiguille |
| Nanofil seringue, 100 ul | Instruments de précision du monde | Nanofil-100 | Comprend aiguilles réutilisables de chargement |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| D'anticorps GFP | Aves | GFP-1020 | |
| D'anticorps DsRed | Clontech | 632496 | |
| Bloc de chauffage | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R la souris | Jackson Laboratory | 003309 |
Références
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we goin....
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Réimpressions et autorisations
