Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.
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Article de méthode
La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les moustiques transmettent un certain nombre de virus distincts, y compris d'importants agents pathogènes humains tels que le virus West Nile, virus de la dengue et le virus chickungunya. Beaucoup de ces virus se sont intensifiées dans leurs gammes endémiques et élargi à de nouveaux territoires, ce qui nécessite des programmes efficaces de surveillance et de contrôle pour répondre à ces menaces. Une stratégie pour surveiller l'activité des virus consiste à recueillir un grand nombre de moustiques à partir de sites endémiques et les tests d'infection virale. Dans cet article, nous décrivons comment manipuler, traiter, et d'un écran prélevés sur le terrain pour les moustiques virus infectieux par un test de culture cellulaire Vero. Les moustiques sont triés par emplacement des pièges et des espèces, et regroupés en pools contenant ≤ 50 individus. Pooled spécimens sont homogénéisés dans une solution saline tamponnée en utilisant un mélangeur-broyeur et la phase aqueuse est inoculé à des confluents des cultures de cellules Vero (Clone E6). Les cultures cellulaires sont surveillés pour effet cytopathique de jours 3-7 après l'inoculation des virus et des mises en culture cellulaire sont identifiés par les tests de diagnostic appropriés. En utilisant cette approche, nous avons isolé 9 virus différent de moustiques collectés dans le Connecticut, USA, et parmi eux, 5 sont connus pour causer la maladie humaine. Trois de ces virus (virus du Nil occidental, le virus de Potosi et La Crosse virus) représentent de nouveaux records pour l'Amérique du Nord ou la région de la Nouvelle-Angleterre depuis 1999. La capacité de détecter une grande diversité de virus est essentielle à la surveillance établis et les nouveaux virus émergents dans la population de moustiques.
Protocole
1. Le tri et l'identification des moustiques
- Les procédures suivantes sont effectuées sur un banc dans un laboratoire ouvert dédié biosécurité de niveau 2 (BSL-2) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler avec les moustiques vivent. Une "chaîne du froid» est maintenu pendant toute la procédure.
- Anesthetize vivent les moustiques adultes en plaçant sac de collecte de moustiques dans un congélateur -20 ° C pendant 5 minutes. Sac de collecte de transfert d'un conteneur isotherme contenant de la glace sèche. Fermer le couvercle et exposer les moustiques au dioxyde de carbone pendant 1-3 minutes pour assurer complète le kn....
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Discussion
Dosage de la culture de cellules Vero sert comme une méthode efficace pour les moustiques écran prélevés sur le terrain pour une diversité des virus. Cela contraste avec les méthodes moléculaires qui ciblent spécifiquement une ou quelques virus d'intérêt. Par ailleurs, nous avons constaté que Vero essai de culture de cellules est tout autant, sinon plus sensible que la RT-PCR 7 et nous fournit des isolats de virus qui sont stockés dans notre collection de référence pour de futures études. Néanmoins, les s.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à souligner la contribution importante des Drs. John Anderson, Andrew Main et Shirley Tirrell à cette étude. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) et le US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 et CONH00773).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif / équipements | Société | Nombre de catalogue | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco - Invitrogen | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco - Invitrogen | 15240 | |
| Le bicarbonate de sodium NaHCO 3, sol. 7,5%. | Gibco - Invitrogen | 25080 | |
| L-Glutamine 200 mM 100x | Invitrogen Gibco- | 25030 | |
| Poudre milieu minimum essentiel (MEM) | Gibco - Invitrogen | 11700 | |
| 10X PBS Dulbecco | Gibco - Invitrogen | 14080 | |
| Trypsine-EDTA | Gibco - Invitrogen | 15400 | |
| Sérum de lapin | Gibco - Invitrogen | 16120 | |
| Cellules Vero (Clone E6) | ATCC | LCR-1586 | |
| Petits flacons de culture tissulaire, capuchons ventilés, 25 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353112 | |
| Grand flacons de culture tissulaire, capuchons ventilés, 175 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353108 | |
| Enduits de cuivre de BB, de 4,5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Racks congélateur ISOPACK | Eppendorf | 022510240 |
Références
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
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Réimpressions et autorisations
