Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

Résumé

Une approche standard pour préparer les adultes Drosophile Les yeux pour les semi-minces et légers sectionnement analyse microscopique est présentée ici. Le protocole peut être utilisé pour l'analyse morphologique brut de défauts oculaires, ou avec les réglages indiqués peuvent être utilisées pour déterminer les exigences génétiques des gènes dans des types cellulaires spécifiques de l'œil (par exemple, l'analyse clonale des photorécepteurs) ou pour l'analyse microscopique des électrons.

Résumé

Drosophile a longtemps été utilisé comme système modèle pour étudier le développement, principalement en raison de la facilité avec laquelle il est génétiquement maniable. Au fil des ans, une pléthore de souches mutantes et des astuces techniques ont été développées pour permettre à des questions complexes pour être posées et répondues dans un délai raisonnable. Aperçu fondamentaux dans le jeu de composants de toutes les voies de signalisation majeures connues a été obtenue en marche avant et arrière études génétiques chez la drosophile. L'œil de la mouche s'est avérée être exceptionnellement bien adapté pour l'analyse mutationnelle, puisque, dans des conditions de laboratoire, les mouches peuvent survivre sans les yeux fonctionnelle. Par ailleurs, la surface de l'œil des insectes est composé de quelque 800 yeux unité individuelle (facettes ou ommatidies) qui forment une base régulière, surface lisse quand on les regarde sous un microscope à dissection. Ainsi, il est facile de voir si une mutation pourrait affecter le développement des yeux ou de croissance externe par la recherche de la perte de la surface lisse («œil rugueux phénotype; Fig 1.) Ou la taille des yeux ensemble, respectivement (pour des exemples d'écrans basés sur la morphologie externe de l'œil voir par exemple ^1). Après des analyses détaillées des phénotypes oculaires nécessitent une fixation, d'inclusion plastique et de fines coupes d'yeux d'adulte.

L'œil de drosophile se développe à partir du disque oeil dits imaginale, un sac de cellules épithéliales qui prolifèrent et se différencient au cours des stades larvaires et la nymphe (pour revue, voir ^deux, par exemple). Chaque ommatidie se compose de 20 cellules, dont huit photorécepteurs (PR ou R-cellules;. Fig 2), quatre cellules de cône cristallin sécrétant, les cellules pigmentaires ('hexagone "autour de R cellule cluster) et un poil. Les photorécepteurs de chaque ommatidie, plus facilement identifiés par leur lumière organites sensibles, le rhabdomeres, sont organisés dans un trapèze composée de six "extérieur" (R1-6) et deux "intérieure" photorécepteurs (R7 / 8; R8 [Fig 2.] est au-dessous R7 et donc seulement vu dans les sections à partir des zones plus profondes de l'œil). Le trapèze de chaque facette est précisément alignées sur celles de ses voisins et les axes antéropostérieur et dorsoventral globale de l'œil (figure 3A). En particulier, les ommatidies de la dorsale et ventrale (flèches noires et rouges, respectivement) moitiés de l'œil sont des images miroir les uns des autres et correspondent à deux formes chirales établi au cours de la signalisation cellulaire polarité planaire (pour revue, voir par exemple ^3).

La méthode pour générer des sections oeil semi-fines (comme celles présentées dans la Fig. 3) décrit ici est légèrement modifiée de celle initialement décrite par Tomlinson et Ready ^4. Il permet l'analyse morphologique de toutes les cellules sauf pour les cellules de cône transparent. De plus, le pigment de la R-cellules (flèches bleues sur la Fig. 2 et 3) peut être utilisé comme un marqueur de cellule autonome pour le génotype d'un R-cellulaires, les exigences ainsi génétique de gènes dans un sous-ensemble de R-cellules peuvent aisément être déterminée ^5,6.

Protocole

1. Volez une dissection tête

1. Assurez vous d'avoir tous les matériaux à portée de main (y compris la gélatine lames revêtues). Préparer le glutaraldéhyde et fixateurs d'osmium (voir ci-dessous). Par génotype d'intégrer, aliquot solution de 200 ul corriger glutaraldéhyde dans des tubes de 1,5 ml sur glace.
2. Anesthetize mouches sur le CO ₂ pad (d'habitude nous dissèquent sept têtes volent à intégrer six par génotype dans le cas d'une tête est détruite pendant la procédure).
3. Tenir et appuyez légèrement le thorax de la mouche, face dorsale en place, avec des pincettes et l'utilisation d'un scalpel pointu pour couper la tête.
4. Stabiliser la tête volée en touchant le cou avec la pince à épiler et soigneusement Couper une petite partie d'un œil. Cela améliore la pénétration du fixateur (si vous avez l'intention d'utiliser vos sections oeil pour analyse clonale, couper l'œil avec des clones pas ou plus petit). Évitez de toucher et d'endommager l'œil intact qui seront ensuite sectionné.
5. Toucher la tête avec des ciseaux ou le bistouri à la surface de l'oeil coupé et le transfert de la tête dans le glutaraldéhyde / phosphate fixatif sur la glace (les têtes flottent souvent sur le dessus du fixateur) Les chefs disséqué devrait pas être conservés dans fix glutaraldéhyde pendant de plus longues de 15 minutes avant l'ajout de l'osmium. Répétez les étapes 1.2 à 1.5 avec les autres mouches du même génotype.

2. Fixation et enrobage (utiliser des gants pour toutes les étapes!)

1. Faites tourner la flyheads de centrifugeuse Eppendorf pendant 1 minute à 10000 rpm. Continue même si les têtes ne tombent pas.
2. Ajouter 200 ul de OsO ₄ solution et correctif pour au moins 30 minutes et jusqu'à 1 heure sur la glace.
3. En utilisant une pipette Pasteur, enlever la solution de glutaraldéhyde / osmium (assurez-vous de la bonne utilisation des procédures d'élimination des déchets!) Et les remplacer avec une solution d'osmium 200 pl. Incuber dans la glace pendant 1-6 heures. Toujours s'assurer que les têtes sont entièrement recouvert de liquide et de ne jamais supprimer l'ensemble des solutions que les chefs ou les yeux pourrait s'effondrer!
4. En utilisant une pipette Pasteur, jetez fixateur, ajouter de l'éthanol 0,5-1ml 30% et incuber pendant au moins 5 minutes sur la glace (assurez-vous de la bonne utilisation des procédures d'élimination des déchets depuis l'éthanol contient maintenant Osmium!).
5. Répétez l'étape ci-dessus avec 50%, 70%, (80%), 90% et deux fois 100% d'éthanol. Inclure l'étape éthanol à 80% si on utilise les yeux pour analyse microscopique des électrons. Après l'étape de lavage à 70%, les échantillons peuvent être retirés de la glace.
6. Remplacer l'éthanol avec un volume égal d'oxyde de propylène (volatiles, continuer à travailler dans la hotte). Incuber 10 minutes à température ambiante.
7. Répétez laver l'oxyde de propylène. Les travaux en lots si le traitement en parallèle de nombreux génotypes afin d'éviter l'effondrement des yeux due à l'évaporation de l'oxyde de propylène.
8. Enlever la plupart de l'oxyde de propylène et de l'aide d'une pipette de transfert en plastique, ajouter environ 500μl d'une résine 01h01: solution d'oxyde de propylène. Equilibrer la nuit à température ambiante.

3. Intégration et l'arrangement dans des moules

1. Assurez-vous que toutes les moules sont étiquetés pour garder trace de vos différents génotypes, puis remplir les moules avec de la résine 100%. Ne remplissez pas trop (pas de "hautes collines" sur la surface des moules en regardant droit dans la surface du moule). Utilisez résine dure pour l'analyse des EM.
2. En utilisant une pipette de transfert, retirer la résine de 50% par les chefs, le remplacer par une résine 100%, et incuber pendant 3-4 heures à température ambiante. Comme les têtes sont infiltrés avec de la résine, ils vont tomber au fond du tube.
3. Utiliser un cure-dent qui a été frappé sur une surface dure une fois pour créer un petit crochet, le transfert d'une tête à la fois dans un moule.
4. Placez une feuille d'aluminium sur la zone de travail de votre champ de dissection pour le protéger contre les déversements de résine.
5. En utilisant une aiguille à dissection et en regardant si votre champ, tourbillon de la tête légèrement dans la résine et soigneusement le déplacer vers le fond du moule à proximité de l'extrémité pointue.
6. Alignez soigneusement la surface de la intacts (!) Oeil (ou votre futur avion de sectionnement, si vous voulez avoir des sections) du cou vers le bas avec la paroi avant du moule, en veillant à garder la surface tangentielle de l'œil à peu près une demi-tête Diamètre loin de la paroi du moule. Dans de rares cas, une effondrements oeil qui peut être vu comme un espace vide entre la surface de l'œil et la cuticule tête. Si vous avez un oeil s'est effondré, le remplacer par le 7 ^ème oeil de rechange.
7. Répétez l'opération avec toutes les têtes. Une fois fait avec tous les alignements, re-vérifier tous les yeux pour s'assurer qu'ils ne bouge pas lorsque vous avez retiré l'aiguille de la résine.
8. Si vous avez des problèmes avec les yeux bouger lorsque vous retirez l'aiguille de dissection, la position de l'oeil comme vous le souhaitez, rentrer rapidement l'aiguille un peu loin de la tête et puis, lentement, retirez l'aiguille complètement.
9. Cuire les moules nuit à 70 ° C.

4. Découper et sectionnement

1. Retirez les blocs durcis à partir des moules en pliant les moules, ksuivre eeping dont bloc correspond à ce qui génotype (par exemple en magasin de petits flacons de scintillation).
2. Pour couper, utilisez un mandrin approprié pour votre microtome qui est monté sur la face visible d'un bloc de plexiglas ou en aluminium. Monter le bloc à l'assiette, l'œil en place, dans le mandrin.
3. Sous le champ de dissection en utilisant un revêtement en téflon de rasoir ordonna, soigneusement coupé seule la couche supérieure de votre bloc. Cela laissera une surface clair cependant que vous devriez voir l'oeil et peut ainsi prédire le futur avion de sectionnement. Évitez de couper les doigts!
4. Coupez l'excédent de plastique sur les deux côtés de la tête et sur le front (c'est à dire ce qui était autrefois le haut du moule lors de l'alignement des yeux) jusqu'à ce que la plupart des plastiques autour de la tête est coupée. Il est préférable de l'approche lentement la tête en coupant plusieurs fines couches de plastique.
5. En utilisant une lame de rasoir propre, retirez soigneusement les couches minces à partir du haut de l'œil dans le plan exact que vous voulez section ultérieure (généralement tangentiellement à l'œil, avec un léger angle de la surface du moule original).
6. Continuez jusqu'à ce que vous venez de commencer à réduire l'écart de la surface externe de l'œil. Assurez-vous que vous utilisez des zones propres de la lame pour obtenir un brillant, surface transparente, ce qui rend plus facile l'alignement dans le microtome.
7. Pour économiser sur les lames de rasoir, utiliser les anciennes lames pour la coupe brute sur les côtés du bloc et de l'utilisation d'une lame de frais pour la garniture fines (d'abord coupé et 4.6). En fin de compte, vous aurez une pyramide à trois côtés avec un peu inclinée, de coupure supérieure qui correspond à votre plan de coupe à venir.
8. Monter le bloc dans le microtome. Sectionnement réelles peuvent varier selon le type de microtome et ne sera pas décrite en détail ici. Nous utilisons un Sorvall MT5000 avec un couteau de diamant de qualité Histo de couper 0,5 à 1 um sections. Pour l'analyse microscopique de lumière, de légères variations dans l'épaisseur section ne compte pas. Si les clones de sectionnement marquée par une section Blanc + transgène, 1 um sections pour s'assurer d'avoir suffisamment de granules pigmentaires à côté de la rhabdomeres par section (fig. 2).
9. Les articles vont flotter sur l'eau. Première levée de 20 à 30 sections avec une extrémité aplatie d'un Q-tip bois par-dessous la surface de l'eau dans un mouvement de rotation et les transférer dans une goutte d'eau sur une lame de verre enduit de gélatine (conservé sur une plaque chauffante à environ 100 ° C ).
10. Répétez l'opération avec une autre de 20 à 30 sections. Attendez que l'eau soit évaporée et les sections coller à la diapositive. Habituellement, des sections de trois yeux disposés en trois colonnes (trois yeux) par des rangées canton (en haut / en bas des sections) cadrent bien sur une lame.

5. Coloration et l'analyse microscopique

1. À moins que des clones de sectionnement, les articles tache. Placer la lame avec des sections sur un bloc chauffant réglé à 90 ° C. Répartir la solution de coloration bleu-toluidine d'une seringue de 30 ml attaché à un filtre à 0.22μm sur la lame et colorer pendant 10 secondes. Rincer immédiatement abondamment avec de l'eau distillée. Air sec.
2. Avec une pipette de transfert en plastique, de distribuer 3 gouttes de milieu de montage DPX sur la lame et couvrir avec une lamelle. Haut avec 3 dimes et laisser le milieu de montage durcir (par exemple la nuit à température ambiante).
3. Image avec un microscope optique. Utilisez un objectif 5x ou 10x de trouver une bonne section et ensuite passer à un objectif à immersion 63x pour une analyse détaillée et à photographier. Nous utilisons habituellement les paramètres de contraste de phase, mais l'optique darkfield travail aussi bien.

6. Les résultats représentatifs:

Le plus souvent, les yeux sont intégrées dans le plastique pour une analyse détaillée des phénotypes oculaires externes rugueuse détecté dans le cadre d'un dépistage génétique ou dans le processus de test des interactions génétiques avec des gènes connus pour affecter la structure des yeux soit en général ou la polarité. Les résultats typiques des sections yeux sont présentés dans la figure 3. De type sauvage ommatidies (figure 3A) montrent le complément photorécepteur pleine entouré par un réseau de cellules pigmentaires. En revanche, dans un strabisme (stbm, alias Van-Gogh ⁷⁾ mutant, la polarité ommatidial est perdu et, même si le complément photorécepteur complète est présente, la rotation et la chiralité sont randomisées (figure 3B). En outre, depuis l'allèle stbm sectionné était en aw ^- fond, les granules pigmentaires sont manquants dans la Fig. 3B. La figure 3C montre un exemple d'une analyse clonale. Drosophile Rho kinase (Drok) est nécessaire pour la rotation ommatidial ainsi que pour l'intégrité structurale de l'œil ^8. Homozygote Drok ^deux clones peuvent être identifiées par l'absence de pigment dans les cellules pigmentaires et les rhabdomeres (typiquement, les clones sont induits en utilisant eyeless-FLP et un P-élément avec un gène marqueur blanc fortement exprimée en complétant une w fond ^- la mutation à l'état sauvage type et le tissu hétérozygote). Il est ainsi possible d'identifier les domaines mutant par leur absence de pigment. En raison de la cellule-autonomie de la pigmentation de la R-CELLS mentionné précédemment, les génotypes individuels des R-cellules peuvent être déterminées (voir flèches sur la Fig. 3C).

Figure 1. L'œil de drosophile est un excellent modèle pour les biologistes, car, contrairement à la surface lisse d'un oeil de type sauvage (A), la surface d'un oeil extérieur mutant est fréquemment rugueuse (B), indicatif de phénotypes oculaire sous-jacente . Dans toutes les figures, antérieure est à gauche et dorsale est en place. Images courtoisie de Dre Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, Etats-Unis.

Figure 2. Lumière images microscopiques du simple ommatidies sectionné en utilisant la méthode décrite. Seuls sept R-cellules sont visibles à la fois par ommatidie, puisque R7 réside sur le dessus de R8. (A, A ') Sur le plan R7, le corps cellulaire du R7 est détecté entre R1 et R6 (flèche jaune en A'). En revanche, au niveau R8 (B), le corps cellulaire du R8 est détecté entre R1 et R2 (flèche jaune en B '). Flèches bleues marquent les granules pigmentaires qui peut être utilisé comme marqueur de cellules pigmentaires-autonome.

Figure 3. Sections tangentielles travers de type sauvage (A), stbm (B) et Drok (C) yeux mutant de drosophile adulte. Schémas ci-dessous les sections indiquent la polarité des ommatidies (voir (A) pour les flèches). Les cercles représentent ommatidies avec des défauts dans le complément de photorécepteur. Les lignes jaunes représentent la ligne dorsale / ventrale de symétrie (équateur). Contrairement à l'ommatidies bien orientée de type sauvage (A), l'organisation planaire est perdu dans le mutant stbm (B). Notez que la section du mutant stbm montré manque de pigments en raison de sa w ^- fond mutant. (C) Parce que les mutations Drok sont mortels, ils doivent être analysés dans les clones. Ainsi, les cellules pigmentées sont de type sauvage ou hétérozygote (pointes de flèche bleue remplie), tandis que R-cellules pigmentaires manquent (ouvert flèches bleues) sont mutant homozygote. En plus de défauts de rotation, les mutants Drok montrent aussi les défauts structurels y compris les numéros manquants ou excès de R-cellules. Notez que pour l'analyse clonale, les sections ne sont pas tachés d'éviter d'obscurcir les granules pigmentaires.

Discussion

En utilisant la drosophile comme organisme modèle, cribles génétiques ont conduit à l'identification de la plupart des membres fondateurs de familles de gènes essentiels à la plupart des voies de signalisation hautement conservée chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains. Puisque, en vertu des conditions de laboratoire, un œil fonctionnel est dispensable pour la survie, l'oeil est un tissu particulièrement bien adapté pour la découverte des fonctions des gènes roman et l'évaluation des réseaux génétiques. Analyse ultrastructurale de l'œil de la mouche à l'aide de la méthode décrite ainsi conduit à des découvertes fondamentales pertinentes pour le développement et la maladie. Initialement, l'analyse seule cellule clonale a été réalisée à l'aide de rayons X induite combiné avec des clones connus étroitement associé cellulaire autonome marqueurs récessifs. Plus récemment, la disponibilité du système FLP / FRT pour générer des clones a grandement facilité l'analyse phénotypique de mutations létales dans les sections ^6,9 oeil.

Analyse des sections œil n'est pas limité aux sections tangentielles décrites ici. Si désiré, les têtes peuvent être alignés dans n'importe quelle orientation dans les moules et les sections transversales peuvent être obtenus à l'étude des couches plus profondes dans la tête, comme la lame et la moelle. Le protocole décrit ici est donc une méthode polyvalente pour les analyses d'adultes tête et des yeux chez la drosophile structures.

Matériaux

Equipement général:

• Pour l'élevage volée général, voir ¹⁰
• Microscope à dissection standard (par exemple Nikon SMZ-645 Microscope zoom stéréo), de préférence avec une source lumineuse anneau pour empêcher une ombre de tes mains.
• Pavé de CO ₂ Fly, couvert de papier Whatman 3MM pour fournir une protection contre la saleté lors de la dissection.
• Gélatine lames revêtues: dissoudre 10g de gélatine et 1g CrKSO ₄ x 12 H ₂ O dans 1 litre d'eau sur une plaque chauffante (amener presque à ébullition, il faut environ 2 heures). Trempez glisse bien lavés (savon) et rincés (dH ₂ O) dans détenteurs en solution de gélatine et sécher à l'air recouvert d'une feuille pendant la nuit.
• Four de chauffage (70 ° C; fours sous vide anciens qui ont été utilisés pour le séchage du filtre de nitrocellulose sont bien adaptés à cet effet).
• Capable de sectionner ultraminces (0,5-1 um sections épaisses) microtome, par exemple, ceux utilisés par les installations microscopie électronique. Nous utilisons un Sorvall MT5000 Ultramicrotome avec un couteau de diamant de qualité Histo. Couteaux de verre également.

Solutions de fixation:

• Préparer une solution stock de 0,2 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,2.
• Préparer glutaraldéhyde à 2% dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2 (peut être conservé à 4 ° C pendant 4 semaines). Faire au moins assez pour avoir 200 pl par génotype que vous souhaitez intégrer. Restez sur la glace.
• Solution de l'osmium: 2% OsO ₄ dans le tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2. Faire juste assez pour avoir 200 pl par génotype que vous souhaitez intégrer, car la solution ne peut pas être stockée. Restez sur la glace.

Glutaraldéhyde et OsO ₄ sont très toxiques et doivent être manipulés avec un soin extrême dans une hotte bien ventilée. Utilisez bouts filtres lors de la manipulation OsO ₄ pour empêcher le noircissement de votre pipette.

Déshydratation: Faire 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, et des solutions d'éthanol à 100%. De préférence fraîche 30%, 50%, 70% d'éthanol sur la glace avant utilisation.

Solution de coloration:

1% de toluidine-bleu dans Borax 1%.

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
	Doux	Dur
Résine A	54g	50g
B Durcisseur	44.5g	50g
Accélérateur C	2.5g	1,75 g
Plastifiant D	10g	0,75 g

Tableau 1. Préparation de résine

Pour préparer la résine, avec soin, mais bien mélanger tous les ingrédients dans un récipient en plastique avec un agitateur magnétique avec un agitateur grande. Eviter les bulles. Après mélange, aliquote dans des flacons de scintillation standard ou contenants similaires et congeler à -20 ° C. Utilisez résine souple pour toutes les applications, sauf si votre installation EM demande la plus difficile la formulation. Utilisez des gants pour manipuler la résine (cancérigène, dans sa forme non polymérisée). À polymériser la résine sur l'équipement et des déchets, cuire au four à 70 ° C pendant la nuit. Les déchets peuvent alors être jeté et l'équipement nettoyé et réutilisé. Renversé en résine non polymérisée peuvent être nettoyées avec de l'isopropanol.

Réactifs	Fournisseur	Le numéro de catalogue
Fly pad	par exemple, Genesee	59-119
Glutaraldéhyde	Sigma	G7526-10 X 10 ML
OsO 4	Polysciences, Inc	0972A-20
Propylene	Fisher	04332-1
Poignées de scalpel, pour # 3	Fisher	22080046
Les lames de bistouri n ° 11	Fisher	08 à 916-5B
Pipettes de transfert	Fisher	13 à 711-7M
Durcupan (R) de résine ACM	Sigma (Fluka)	44610-1EA
Aiguilles en acier dissection	Fisher	S17346
Moisissures BEEM intégration plat	Electron Microscopy Sci.	70904-12
Lames de rasoir revêtement Teflon	Electron Microscopy Sci.	71970
Q-tip (tampons stériles)	Fisher	14-959-81
Lames de verre	Fisher	12-550-143
Couverture glisse n ° 1, 22X60 mm	Fisher	12-531K
Gélatine	Fisher	ICN96010280
Cr (III) K SO 4 dodécahydraté	Sigma	243361
Diamant Histo couteau, 6mm	Diatome américain	60-Son
Bleu de toluidine O	Fisher	BP107-10
Borax (Na-Tétraborate)	Fisher	AC20629-1000
DPX milieu de montage	Sigma	44581-100ML

Tableau 2. Matériaux