Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des colonies métastatiques
- Au jour 5 après l’injection, retirez les embryons de l’incubateur et inspectez les CAM embryonnaires pour la distribution métastatique des colonies. Identifiez les embryons avec une distribution uniforme des colonies dans lesquelles des colonies compactes (ou trop envahissantes) sont présentes.
note: Le processus de culture des embryons de poulet n’est pas stérile, par conséquent, toutes les étapes de dépistage doivent être effectuées dans des conditions très propres pour éviter toute contamination future de la culture tissulaire. La contamination est assez rare et peut être facilement évitée en portant des gants et un masque et en utilisant uniquement des outils stériles lors des procédures d’injection cellulaire et d’isolement de la colonie. Il est recommandé d’inspecter les embryons un par un afin de réduire leur exposition à la température ambiante du laboratoire et d’éviter la contamination.
- Localisez la colonie métastatique d’intérêt. Une colonie compacte peut être décrite comme une colonie dont la plupart des cellules cancéreuses sont situées dans une zone limitée du tissu CAM (les cellules semblent « agglomérées »). Une colonie invasive peut être décrite comme une colonie où les cellules cancéreuses se « dispersent » dans le tissu CAM (Figure 1A, B).
REMARQUE : La « compacité » de la colonie métastatique peut s’expliquer soit par l’inhibition de l’invasion des cellules cancéreuses, soit par l’inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses, soit par les deux. Il faut porter attention à tous les scénarios, et les colonies de contact doivent être isolées (figures 1A, B). Un simple stéréomicroscope fluorescent peut être utilisé pour distinguer les phénotypes de colonies métastatiques compactes et invasives.
- Sous le microscope de dissection, tirez doucement le tissu CAM qui contient la colonie métastatique d’intérêt vers le haut à l’aide de pinces fines (Figure 1C).
- Coupez le tissu CAM qui contient la colonie métastatique à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Transférez le tissu CAM qui contient la colonie métastatique dans un tube vide et stérile de 1,5 mL (sur de la glace) et fermez le couvercle du tube.
note: Les colonies isolées peuvent être conservées sur glace jusqu’à 3 h sans perte de viabilité.
- Répétez la procédure d’excision jusqu’à ce que toutes les colonies d’intérêt soient rassemblées dans des tubes séparés. Pour éviter la souffrance animale, n’excisez pas plus de 2 à 3 colonies d’un embryon. Euthanasier les embryons par congélation à -20 °C (ou autre méthode approuvée) immédiatement après l’excision de la colonie.
- Hachez doucement le tissu CAM dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une aiguille stérile 18G. Utilisez une aiguille distincte pour chaque colonie.
- Ajouter 100 μL de 1x solution de collagénase et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Faites tourner les cellules et le tissu CAM à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirez la solution de collagénase et mettez les cellules en suspension dans un milieu complet utilisé pour la lignée cellulaire d’intérêt.
note: Normalement, le tissu CAM n’est pas complètement dissocié après le traitement à la collagénase, et les cellules cancéreuses prolifèrent d’abord dans les morceaux de tissu CAM et ne migrent que plus tard dans la boîte de culture tissulaire.
- Faites tourner à nouveau les cellules et le tissu CAM à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules et les morceaux de tissu CAM dans 1 mL de milieu complet plus le facteur de sélection (le cas échéant), puis transférer dans une seule boîte de culture tissulaire à 12 puits de culture tissulaire.
note: Les fibroblastes de MCP de poulet peuvent persister en culture tissulaire pour plusieurs passages, inhibant l’expansion clonale. La capacité d’étendre les colonies métastatiques en présence d’un facteur de sélection (c’est-à-dire si un vecteur utilisé pour rendre les cellules cancéreuses fluorescentes code également pour un gène de résistance aux antibiotiques chez les mammifères) peut accélérer considérablement l’expansion clonale. Une expérience de courbe de destruction doit être effectuée avant le dépistage pour s’assurer que la bonne concentration d’antibiotiques est utilisée.
- Pendant les 1 à 3 prochaines semaines, surveillez quotidiennement la croissance et la contamination des cellules cancéreuses.
- Lorsque les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, transférez-les dans une boîte de culture de plus grand volume.
note: Il est recommandé d’étendre les cellules jusqu’à ce qu’au moins deux flacons cryogéniques de chaque clone puissent être congelés. Le maintien de grandes quantités de culture tissulaire peut être laborieux et inutile.
- Passez au séquençage ou à la prochaine ronde de sélection dès que le nombre suffisant de cellules cancéreuses est atteint. En général, 1 x 106 des cellules cancéreuses sont suffisantes pour les techniques modernes de séquençage à haut débit.
- Procéder à la réinjection du clone et à l’imagerie et à la quantification de la compacité de la colonie ou du contact cellule-vaisseau sanguin du cancer (Figure 2A). Vous pouvez également procéder au séquençage à haut débit ou répéter la sélection de la colonie.
REMARQUE : Pour réduire le nombre de faux positifs, il est recommandé d’effectuer au moins deux tours de sélection. Deux approches ont été employées avec succès. 1) Élargissez chaque clone et réinjectez-le individuellement pour confirmer le phénotype de la colonie. 2) Mélangez tous les clones expansés dans un rapport de 1:1 chacun, réinjectez-les sous forme de mélange et répétez le cycle de sélection.
