Isolement et culture de cellules épithéliales de la langue murine : une procédure pour isoler et cultiver des cellules épithéliales de la langue à partir d’un modèle murin

Résumé

Source : Prasad, M. et al. Établissement in vitro d’une lignée cellulaire murine de cancer de la tête et du cou génétiquement modifiée à l’aide d’un système Virus-Cas9 adéno-associé. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous décrivons l’isolement des cellules épithéliales d’une langue murine. Ces cellules peuvent être cultivées davantage pour donner naissance à des colonies cellulaires.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Isolement et culture de cellules primaires

1. Euthanasier un mâle ou une femelle B6 de 6 semaines ; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J par asphyxie au CO₂ ou tout autre protocole approuvé par l’IACUC.
   note: Ces souris knockin CRISPR/Cas9 ont une expression dépendante de la recombinase Cre de l’endonucléase cas9 et de l’EGFP dirigée par un promoteur CAG. La séquence amont Lox-Stop-Lox (LSL) présente dans le génome de ces souris empêche l’expression de Cas9 et EGFP en l’absence de recombinase Cre. Lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des ARN guides simples (ARNsg) et une source Cre, ils permettent de modifier un ou plusieurs gènes de souris in vivo ou ex vivo.
2. Disséquez la langue des souris euthanasiées à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
3. Dissociez manuellement le tissu en hachant le tissu de la langue en très petits fragments à l’aide d’un scalpel. Prélever les fragments de tissu dans un tube de 15 mL contenant 4,5 mL de milieu ordinaire RPMI (sans sérum).
4. Ajouter le mélange de trois enzymes (200 μL) (voir le tableau 1 pour la recette) aux fragments de tissu.
5. Incuber le mélange tissu-enzyme à 37 °C pendant 30 min et tapoter le tube toutes les 10 min pour améliorer la dissociation enzymatique du tissu.
6. Ajoutez 5 % de sérum fœtal bovin (FBS) contenant HBSS/PBS au mélange tissu-enzyme pour arrêter l’action enzymatique.
7. Filtrez la suspension cellulaire ci-dessus à travers un treillis en nylon stérile de 70 μm pour séparer les cellules dispersées et les fragments de tissu plus gros.
8. Laver la suspension cellulaire filtrée par centrifugation pour 300 x g pendant 5 min dans HBSS/PBS à RT.
9. Remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture (10 % FBS dans RPMI/DMEM) et la faire croître dans des boîtes de culture de 60 mm jusqu’à ce que des colonies cellulaires distinctes se forment.
   1. Les agrégats de cellules de culture sont conservés sur le dessus du filtre dans une boîte de culture de 60 mm contenant 3 mL de milieu complet (10 % FBS dans RPMI/DMEM) jusqu’à ce que des colonies cellulaires se forment.
10. Examiner au microscope les cellules primaires pour détecter la présence d’une contamination par les fibroblastes après 1 semaine de culture. Traiter les cellules primaires développées à partir d’agrégats et de suspensions cellulaires avec une solution d’EDTA à 0,25 trypsine à 0,02 % à 37 °C pendant 1 min pour éliminer les fibroblastes.
    note: Habituellement, la culture primaire à partir d’agrégats cellulaires produit plus de colonies que les suspensions unicellulaires. Les cellules de ces colonies offrent une meilleure efficacité de transduction avec la transduction AAV.

10X Triple Solution Enzyme Mère :
Collagènase	1 g de conc. final [10 mg/mL]
Hyaluronidase	100 mg [1 mg/mL]
DNase	20 000 unités conc. final [200 mg/mL]
PBS 1X	Préparation jusqu’à 100 ml

Tableau 1 : Recette du tampon utilisé dans cette étude

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souches de souris
Réf. C57BL/6	Envigo
B6 ; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Laboratoires Jackson	Référence 24857
hocher. CB17-PRKDC-SCID/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo
Enzymes
Benzonase	sigma	E1014
Collagénase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
ADN	Thermo Fisher Scientific	18047019
Hyaluronidase	MilliporeSigma	N° H3506
trypsine	Industries biologiques Israël BeitHaemek Ltd.	Référence 03-050-1B
Milieux de culture, produits chimiques et réactifs
Bsa	Amresco	0332-TAM-50G
DMEM	Industries biologiques Israël BeitHaemek Ltd.	Référence 01-055-1A
FBS	Industries biologiques Israël BeitHaemek Ltd.	Référence 04-127-1A
HBSS	sigma	N° H6648
Pbs	Industries biologiques Israël BeitHaemek Ltd.	Référence 02-023-1A
Tampon Tris	MERCK Millipore	Référence 648311-1KG
Articles en plastique
Filtre Amicon-ULTRA 100 KDa	Millipore	UFC910024
Filtres stériles de 0,22 μm, 4 mm	Millex	SLGV004SL
Filtres stériles de 0,45 μm, 13 mm	Millex	SLHV013SL
Plaques de culture	Greiner Bio-One
Tubes Falcon	Greiner Bio-One