Prétraitement tissulaire FFPE pour l’ARN CISH : une procédure pour traiter des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine pour l’hybridation in situ chromogène de l’ARN

Résumé

Source : Outh-Gauer, S. et al. Hybridation in situ chromogène comme outil de diagnostic du cancer de la tête et du cou lié au VPH. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre les étapes du prétraitement des échantillons de tissus FFPE pour l’hybridation in situ chromogène de l’ARN. Le processus de prétraitement aide à maintenir l’intégrité des acides nucléiques dans les cellules et la morphologie globale des tissus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation des matériaux

1. Préparation de 1x réactif de récupération de cible
   1. Dans un grand bécher, ajoutez 70 ml de réactif de récupération de cible 10x (voir le tableau des matériaux) à 630 ml d’eau distillée.
   2. Placez le bécher sur une plaque chauffante à l’aide d’un agitateur magnétique. Couvrez-le de papier d’aluminium.
   3. Faire bouillir son contenu à 100 °C pendant 10 à 15 min
      REMARQUE : Ne laissez pas bouillir plus de 30 min.

2. Prétraitement tissulaire

REMARQUE : Ces étapes suivent la recommandation de prétraitement « standard » selon les instructions du fabricant pour les échantillons de tête et de cou. Il peut être nécessaire d’ajuster le moment des sections 2.1 et 2.2 en fonction du tissu manipulé.

1. Blocage de l’activité de la peroxydase
   1. Ajoutez 4 à 6 gouttes de peroxyde d’hydrogène (voir le tableau des matériaux) à chaque lame et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante.
   2. Lavez les lames 2x pendant 2 min dans de l’eau distillée à température ambiante.
2. Rupture des liaisons ARN/tissu
   1. À l’aide d’une griffe, retirez la feuille d’aluminium du réactif de récupération de cible 1x (TTR1x) placé sur une plaque chauffante et arrêtez de remuer. Immergez la grille coulissante lentement et très soigneusement pendant 15 min. Couvrez à nouveau le bécher avec du papier d’aluminium.
      note: Le frémissement doit persister pendant cette étape.
      prudence: Utilisez la griffe pour manipuler la feuille d’aluminium et le support de glissière pour éviter les brûlures. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié, comme des gants et une blouse de laboratoire.
   2. Avec la griffe, transférez immédiatement la grille de diapositives chaudes dans un bain-marie distillé et lavez-la pendant 2 min.
      note: Assurez-vous que les échantillons ne refroidissent pas dans le TTR1x.
   3. Lavez les lames dans de l’éthanol frais à 100 % pendant 2 min.
   4. Laissez sécher les lames à température ambiante pendant 2 min.
3. Création d’une barrière
   1. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe (voir le tableau des matériaux), tracez une barrière autour de l’échantillon. Laissez sécher pendant au moins 5 min.
      note: Laissez la barrière se dessécher vraiment. S’il s’use pendant l’intervention, n’hésitez pas à le dessiner à nouveau. Évitez de toucher le mouchoir avec le stylo. Le protocole peut y être interrompu pendant la nuit.
4. Digestion de la protéase
   1. Placez les lames sur le support à lames et ajoutez ~4 gouttes de Protease Plus par échantillon (voir le tableau des matériaux).
   2. Couvrez le plateau de contrôle de l’humidité avec un couvercle et insérez-le dans le four d’hybridation pendant 30 min à 40 °C.
      note: Pour éviter l’évaporation, assurez-vous que le bouton rotatif est complètement tourné en position de verrouillage.
   3. Sortez la plaque du four et retirez la grille coulissante.
   4. Une lame à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la lame dans un support à lames immergé dans un plat de coloration rempli d’eau distillée.
   5. Lavez les lames 2x pendant 2 min dans de l’eau distillée à température ambiante. Agitez constamment.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Four HybEZ (110v)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	Référence 321710
Porte-glissières HybEZ	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
Stylo barrière hydrophobe ImmEdge	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018
RNAscope H202 et réactif Protéase Plus	Advanced Cell Diagnostics Inc.	Référence 322330	Peroxyde d’hydrogène x2 et Protéase Plus x 1
Réactifs de récupération de cibles RNAscope	Advanced Cell Diagnostics Inc.	Référence 322000