1. Préparation des réactifs de contre-coloration
- Préparez 50 % d’hématoxyline.
- Dans une hotte, ajoutez 100 ml d’hématoxyline I de Gill (voir le tableau des matériaux) à 100 ml d’eau distillée dans un plat de coloration.
note: La solution de coloration à l’hématoxyline à 50 % peut être réutilisée jusqu’à 1 semaine.
- Préparez de l’eau ammoniacale à 0,02 % (p/v) (réactif de bleuissement).
- Dans la hotte, ajouter 1,43 mL d’hydroxyde d’ammonium 1 N à 250 mL d’eau distillée dans un cylindre gradué ou un autre contenant. Scellez le cylindre avec un film de paraffine. Mélangez bien son contenu pour 3x–5x.
note: Pour la quantification par essai, il est essentiel d’utiliser de l’hydroxyde d’ammonium. Les réactifs peuvent être préparés à l’avance. Assurez-vous que tous les contenants restent couverts.
2. Détection de signal avec la 3,3'-diaminobenzidine
ATTENTION : La diaminobenzidine (DAB) est toxique. Suivez les précautions et les directives de sécurité appropriées lors de l’élimination et de la manipulation de ce produit chimique.
- Mélangez des volumes égaux de DAB-A et de DAB-B (voir le tableau des matériaux) dans un tube de taille appropriée en distribuant le même nombre de gouttes de chaque solution. Produire ~120 μL de substrat DAB par section (~2 gouttes de chaque réactif/total de 4). Mélangez bien pour 3x–5x.
- Prenez chaque diapositive, une à la fois, du support à glissières et tapotez et/ou effleurez pour retirer l’excès de liquide avant de la placer dans le support à glissières.
- Pipeter ~120 μL de DAB sur chaque section de tissu. Assurez-vous que les sections sont couvertes et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
- Jetez le DAB restant conformément à la réglementation locale et insérez la diapositive dans un support à lames immergé dans un plat de coloration rempli d’eau du robinet.
3. Contre-coloration
- Placez la grille coulissante dans un plat de coloration contenant 50 % de solution de coloration à l’hématoxyline et laissez-la reposer pendant 30 s à température ambiante. Notez que les diapositives deviendront violettes.
- Remettez immédiatement le support à lames dans un plat de coloration contenant de l’eau du robinet et lavez les lames 3 à 5 fois en déplaçant le support de haut en bas.
- Répétez l’étape de lavage avec de l’eau fraîche du robinet jusqu’à ce que les lames soient dégagées tandis que les sections restent violettes.
- Remplacez l’eau du robinet dans le plat de coloration par de l’eau ammoniacale à 0,02 %. Déplacez le rack vers le haut ou vers le bas 2 à 3 fois. Notez que la section du tissu doit devenir bleue.
- Remplacez l’eau ammoniacale par de l’eau du robinet. Lavez les lames 3 à 5 fois.
4. Déshydratation
- Déplacez la grille coulissante dans un plat de coloration contenant 70 % d’éthanol dans la hotte et laissez-la reposer pendant 2 minutes en agitant de temps en temps.
- Déplacez la grille coulissante dans un premier plat de coloration contenant 100 % d’éthanol et laissez-la reposer pendant 2 min en agitant de temps en temps.
- Déplacez la grille coulissante dans un deuxième plat de coloration contenant 100 % d’éthanol et laissez-le reposer pendant 2 minutes en agitant de temps en temps.
- Déplacez la grille coulissante dans un plat de coloration contenant du xylène et laissez-la reposer pendant 5 minutes en l’agitant de temps en temps.
5. Montage de la glissière
- Retirez les lames du support à glissières et posez-les à plat, les sections vers le haut dans la hotte.
- Montez une lame à la fois en ajoutant 1 goutte d’un support de montage à base de xylène à chaque lame et en plaçant soigneusement une lamelle de 24 mm x 50 mm sur la section. Évitez de piéger des bulles d’air.
- Faites sécher les lames à l’air libre pendant ≥5 min.
6. Évaluation de l’échantillon
- Examinez les coupes de tissus à l’aide d’un microscope à fond clair standard avec un grossissement de 20x à 40x.
