Récolte de DRG à partir de la colonne vertébrale du rat : une procédure pour extraire le ganglion de la racine dorsale de la colonne vertébrale d’un modèle de rat

Résumé

Source : Schmidt, L. B. et al. Le modèle in vivo de la membrane chorioallantoïde du poussin pour évaluer l’invasion périneurale dans le cancer de la tête et du cou. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’extraction du ganglion de la racine dorsale ou DRG d’une épine de rat récoltée pour des applications en aval.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Récolte et préparation des DRG (temps estimé : 2 h, jour 8)

REMARQUE : Les expériences sur des souris et des rats nécessitent l’approbation de l’IACUC. Dans certains pays, l’utilisation d’œufs de poule nécessite également une approbation.

1. Obtenez des rats Sprague Dawley âgés de six à sept semaines (~200 g de poids) pour extraire les DRGs.
   note: Un rat devrait produire ~40 DRG cervicales et thoraciques. Cependant, les conditions pour cette espèce doivent être optimisées indépendamment.
2. Dans une armoire à flux laminaire, prélevez des DRG dans les régions cervicales et thoraciques en suivant le protocole d’extraction des DRG de souris publié ailleurs. Suivez la figure 1 pour obtenir des instructions sur la façon de récolter des DRG.
   1. Euthanasier le rat par ponction cardiaque après administration de kétamine/xylazine injectée par voie intrapéritonéale. Nettoyez la peau du rat avec de l’éthanol à 70 % et retirez la colonne vertébrale du rat à l’aide de ciseaux. N’effectuez pas de luxation cervicale car cela endommagerait les DRG cervicaux.
   2. Séparez les régions cervicale, thoracique et lombaire avec les mêmes ciseaux, en suivant la représentation anatomique schématique et les images grossières fournies dans la figure 1A-D. Placez les sections de la colonne vertébrale dans une boîte de culture de 10 cm avec 1X PBS pour garder les tissus humides.
   3. À l’aide d’un ciseau à os délicat, ouvrez les os vertébraux dans les faces dorsale et ventrale, en séparant la colonne vertébrale en deux moitiés latérales (Figure 1E-F). Placez les sections de tissu dans un plat propre de 10 cm avec du PBS frais 1X.
   4. À l’aide d’une pince, détachez doucement la moelle épinière des os vertébraux pour visualiser les DRG (Figure 1G).
   5. À l’aide d’une pince fine placée sous chaque DRG, saisissez-la et retirez-la de la cavité osseuse dans laquelle elle est logée. Ne tenez pas le DRG directement car cela causerait des dommages aux tissus. Ne coupez pas les faisceaux axonaux du DRG (Figure 1H).
      note: Évitez d’utiliser des DRG lombaires car ceux-ci ont réduit l’intégration dans le CAM. Pour l’emplacement de la région DRG, suivez l’illustration schématique et les images anatomiques grossières de la figure 1A-D.
3. Immédiatement après la récolte, placez chaque DRG dans un milieu de culture DMEM complété par 2 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptocoque) et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) pour aider à prévenir la contamination bactérienne des DRG
4. Après avoir récolté tous les DRG, transférez-les dans une nouvelle boîte de culture avec un milieu de culture DMEM complété par 2 % de Pen/Strep plus 10 % de FBS et contenant 1,25 μg/mL de colorant fluorescent rouge. Incuber pendant 1 h dans l’incubateur de culture cellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	# 10010-023	Saline tamponnée au phosphate
Rats Sprague Dawley (femelles)	Laboratoires de Charles River	Code de souche : 001	6-7 semaines (poids 190-210g)
Pince fine Dumont # 5	Outils scientifiques fins (FST)	# 11254-20	Utilisé pour récolter le DRG
Pince Graefe extra fine, incurvée	Outils scientifiques fins (FST)	# 11151-10	Utilisé pour greffer du DRG sur le CAM le jour 8 et pour prélever du tissu CAM le jour 17
Pince Graefe extra fine, droite	Outils scientifiques fins (FST)	# 11150-10	Utilisé pour greffer du DRG sur le CAM le jour 8 et pour prélever du tissu CAM le jour 17
DMEM (1x)	Gibco	# 11965-092	Aigle Medium modifié de Dulbeecco
Colorant fluorescent CellTracker Red CMTPX	Technologies de la vie	Réf. C34552	Reconstituer 50μg dans 40μL de DMSO et stocker à -20oC. Utiliser 1 μL de solution mère/mL de milieu de culture
Stylo/Streptocoque	Gibco	# 15140-122	10 000 unités/mL de péniciline, 10 000 μg/mL de streptomycine
SALUT FBS	Gibco	# 10082-147	Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur
Dmso	Bioréactifs Fisher	# BP231-100	Sulfoxyde de diméthyle