Modèle de tumeur à membrane chorioallantoïde de poulet ou CAM : une méthode in ovo pour simuler l’invasion périneurale des cellules tumorales

Résumé

Source : Schmidt, L. B. et al. Le modèle in vivo de la membrane chorioallantoïde du poussin pour évaluer l’invasion périneurale dans le cancer de la tête et du cou. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode de co-culture des ganglions de la racine dorsale et des cellules cancéreuses sur la membrane chorioallantoïde du poulet ou CAM pour étudier l’invasion périneurale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Greffage DRG sur le CAM (temps estimé : 40 min, jour 8)

1. Préparez une boîte de culture de 6 cm avec un milieu HBSS pour laver les DRG avant l’implantation. Apportez les œufs préparés dans l’armoire à flux laminaire de la culture cellulaire. Retirez la membrane de paraffine de l’œuf (Figure 1A).
2. À l’aide d’une pince stérile fine, saisissez doucement un DRG à l’intérieur du milieu de culture. Trempez-le dans le milieu HBSS pour enlever l’excès de médium qui contient le colorant fluorescent. Tenez le DRG très doucement ; Sinon, il collera aux pinces.
3. Placez le DRG sur la CAM en prenant soin de ne pas perforer la membrane (Figure 1B-C). Si nécessaire, utilisez une autre paire de pinces pour aider à détacher le DRG de la pointe de la pince lorsque vous le placez sur le CAM.
   note: Garder le DRG humide avec un milieu HBSS facilitera également le détachement de la pince.
4. Couvrez l’œuf d’un film transparent stérile. Couvrez toutes les fenêtres et les perforations faites dans la coquille de l’œuf pour éviter la contamination bactérienne (figure 1D).
5. Après avoir greffé des DRG dans tous les œufs, incubez les œufs dans un incubateur humidificateur à 38 °C et 54 % d’humidité pendant 2 jours, sans rotation.

2. Greffe de cellules tumorales sur le CAM (durée estimée : 1 h 30 min, jour 10)

1. A 48 h avant de greffer les cellules, plaquez les cellules nécessaires dans les plaques de culture. Calculer 0,5 à 1 x 10⁶ cellules par ovule pour les cellules UM-SCC-1 afin de générer des tumeurs tridimensionnelles dans le CAM. Sachez que le nombre de cellules peut varier selon la lignée cellulaire.
2. Aspirez le milieu et ajoutez du milieu de culture DMEM complété par 1 % de Pen/Strep plus 10 % de FBS et 2,5 μg/mL de colorant fluorescent vert. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire. Ensuite, vérifiez l’intensité de la fluorescence au microscope, aspirez le milieu, lavez une fois avec 1X PBS et ajoutez 0,25 % de trypsine pendant 10 minutes maximum. Neutralisez la trypsine avec un milieu supplémenté en DMEM.
3. Centrifuger à 250 x g pendant 4 min pour former une pastille de cellule. Aspirez le médium DMEM et mettez-le en suspension dans HBSS pour laver l’excès de colorant fluorescent. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
4. Apportez les ovules dans l’armoire à flux laminaire de la culture cellulaire. À l’aide de ciseaux et d’une pince, ouvrez le film transparent qui recouvre l’œuf (figure 1E-F).
5. Centrifuger à nouveau le nombre calculé de cellules, aspirer le milieu HBSS et remettre en suspension à une concentration finale de 0,5 à 1 x 10⁶ cellules par 5 μL du même milieu (figure 1G). Préparez la quantité nécessaire pour le nombre total d’œufs (5 μL de suspension cellulaire par œuf).
6. Placez 5 μL de solution cellulaire sur le CAM, à environ 2 mm du DRG (Figure 1H). Maintenez des distances uniformes entre le DRG et les cellules. Faites très attention à ne pas déranger l’ovule pour minimiser la propagation des cellules.
   note: Pour commencer l’implantation cellulaire, choisissez des ovules sur lesquels la surface CAM est visuellement sèche. Si la surface est trop humide, les cellules peuvent se propager et ne pas former de tumeurs régulières.
7. Couvrez l’œuf d’un nouveau film comme à l’étape 1.4. Greffez les cellules de tous les ovules. Incuber les œufs dans un incubateur humidificateur à 38 °C et 54 % d’humidité pendant 7 jours, sans rotation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Couveuse d’œufs	GQF Sportif Numérique	#1502	Couveuse à œufs équipée d’un rotateur automatique, d’un thermostat numérique, de commandes de température et d’humidité
Coupe-gravure	DREMEL	#108	Utilisé pour percer la coquille de l’œuf
Pince Graefe extra fine, incurvée	Outils scientifiques fins (FST)	Référence 11151-10	Utilisé pour greffer du DRG sur le CAM le jour 8 et pour prélever le CAMtissue le jour 17
Pince Graefe extra fine, droite	Outils scientifiques fins (FST)	Référence 11150-10	Utilisé pour greffer du DRG sur le CAM le jour 8 et pour prélever du tissu CAM le jour 17
Œufs de Lohmann White Leghorn fécondés			Ovules fécondés aux premiers jours de la fécondation, de préférence le premier jour après la fécondation. Les œufs utilisés dans ce protocole proviennent de la ferme avicole de l’Université d’État du Michigan.
Pinces à filtre	EMD Millipore	#XX6200006P	Pince émoussée utilisée pour retirer la coquille de l’œuf
HBSS (1x)	Gibco	Réf. 14025-092	La solution saline équilibrée de Hank
Membrane de cire de paraffine	Film de laboratoire Parafilm	#PM-996	Utilisé pour couvrir temporairement les ouvertures des œufs jusqu’à la greffe DRG le jour 8
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	#10010-023	Saline tamponnée au phosphate
Pansement en film transparent Tegaderm	3m	#9505W	Stérile, 6x7cm utilisé pour couvrir les ouvertures des œufs pendant l’incubation