Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Inoculation des cellules sur le flanc et traitement par antagonologie intratumorale
- Préparation cellulaire
- Concevoir une lignée cellulaire de cancer de la thyroïde humain Cal62 (mutations KRASG12R et p53A161D) pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement la GFP et la luciférase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Sélectionnez les cellules transgéniques en fonction de leur résistance aux antibiotiques ou en triant les cellules positives à la GFP par cytométrie en flux.
- Cultivez les cellules dans le milieu d'Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par de la pénicilline, de la streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 °C et 5 % de CO2.
- Mettre en suspension 1 x 106 cellules dans 50 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 °C.
- Inoculation cellulaire dans les flancs de souris
- Mélangez les cellules avec la même quantité de matrice de membrane basale. Par exemple, ajoutez 1 x 106 cellules dans 50 μL de PBS à 50 μL de matrice de membrane basale (voir le tableau des matériaux) et mélangez délicatement.
- Injecter 100 μL de l'échantillon (cellules dans le PBS + matrice de la membrane basale) par voie sous-cutanée dans le flanc gauche de souris BALB/c nu/nu immunodéficientes âgées de 6 semaines à l'aide d'une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille 27G 1/2'' (0,4 x 13 mm).
- Traitement antitumoral par antagomiR
- Mettre en suspension l’antagomiR (voir tableau des matériaux) ou le témoin négatif dans 500 μL d’eau distillée sans RNase.
- Avant l’injection, préparer 2 nmol de l’antagomiR ou du témoin avec un réactif d’administration in vivo (voir le tableau des matériaux) pour chaque injection.
- Mélangez d’abord la solution d’antagomiR (voir Tableau des matériaux) et le tampon de complexation (voir Tableau des matériaux) dans un rapport de 1:1. Par exemple, ajoutez 80 μL de solution d’inhibiteur de miARN (16 nmol) à 80 μL de tampon de complexation (inclus dans le kit de réactifs d’administration in vivo, voir le tableau des matériaux).
- Amener le réactif d’administration in vivo à température ambiante. Ajouter 160 μL dans un tube de 1,5 mL et ajouter immédiatement 160 μL de solution d’antagomiR diluée. Ramener le réactif restant à -20 °C. Si nécessaire, conservez le réactif à 4 °C jusqu’à une semaine après la décongélation.
- Vortex immédiatement (10 s) pour assurer la complexation du réactif d’administration in vivo-antagomiR.
- Incuber le mélange réactif-antagomiR in vivo pendant 30 min à 50 °C. Centrifuger brièvement le tube pour récupérer l’échantillon.
- Diluez le complexe 6 fois en ajoutant 1360 μL de PBS pH 7,4 et mélangez bien.
- Procéder à l’administration in vivo du complexe réactif-antagomiR (8 souris/condition) ou stocker le complexe à 4 °C jusqu’à une semaine avant l’injection. Injecter 200 μL par voie intratumorale dans chaque tumeur (2 nmol d’antagomiR).
REMARQUE : Le volume et la quantité de l’antagomiR sont indépendants du volume tumoral.
- Effectuez le traitement 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pendant 2 semaines.
- Analyse de la croissance tumorale
- Injecter 50 μL d'une solution à 40 mg/mL de substrat de D-luciférine (voir le tableau des matériaux) par voie sous-cutanée à chaque point temporel avec une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- 8 minutes après l’injection, anesthésiez les souris à l’aide de 3 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène. Évaluer le niveau d’anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil) et ajuster l’administration de l’anesthésie au besoin pour maintenir le plan chirurgical.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation.
- Imagez le signal bioluminescent avec un logiciel d’imagerie in vivo (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Les pieds à coulisse peuvent également être utilisés pour mesurer le volume tumoral et la croissance tumorale.
- Une fois les signaux de bioluminescence obtenus, analysez la croissance tumorale en comparant les deux traitements et déterminez la signification à l’aide d’un test t. Pour analyser la variance au sein d’un groupe, utilisez le SEM.
