Intégration de sphéroïdes 3D dans des gouttes de gel d’agarose : une technique pour préserver les sphéroïdes pour l’analyse en aval

Résumé

Source : Rolver, M. G. et al. Évaluation de la viabilité et de la mort cellulaires dans des cultures sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit la technique d’intégration de sphéroïdes 3D dans des gouttes de gel d’agarose pour la conservation. Les sphéroïdes 3D intégrés peuvent être utilisés pour l’analyse en aval.

Protocole

1. Intégration de sphéroïdes 3D

1. Préparez le gel d’agarose dans lequel les sphéroïdes sont intégrés (nécessaire uniquement lors de la première exécution du protocole)
   1. Mélanger 1 g de bacto-agar dans 50 mL de ddH₂O.
   2. Chauffer lentement au four à micro-ondes jusqu’à ce que le bacto-agar soit dissous et qu’un gel homogène se forme. Ne laissez pas le gel bouillir.
   3. Maintenir le bacto-agar au chaud dans un bain-marie à 60 °C.
   4. Maintenir à 4 °C entre les expériences.
2. Enrobage de sphéroïdes
   1. Le jour 1, pour chaque condition, mettez en commun un minimum de 12 sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml.
   2. Lavez une fois avec 1 mL de 1X PBS glacé.
   3. Pour fixer les sphéroïdes, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 %.
      note: La manipulation du paraformaldéhyde doit être effectuée dans une hotte.
   4. Laissez-les incuber pendant 24 h à RT.
   5. Le jour 2, chauffez soigneusement le gel d’agarose en le plaçant dans un bécher rempli d’eau dans un four à micro-ondes. Assurez-vous que le gel ne bout pas. Garder au chaud sur une plaque chauffante de paillasse, à 60 °C jusqu’à utilisation.
   6. Lavez les sphéroïdes deux fois avec 1 mL de PBS 1X glacé.
   7. Aspirez la majeure partie du 1X PBS (laisser environ 100 μL à ce stade est pratique pour manipuler les sphéroïdes).
   8. Préparez une pipette de 20 μL en coupant la pointe de la pipette en pente pour obtenir une pointe plus pointue avec un trou plus grand (Figure 1).
      REMARQUE : La partie suivante doit être effectuée rapidement pour assurer un transfert optimal des sphéroïdes et pour éviter la solidification de la chute de gel. S’il n’y a pas de bloc chauffant disponible, il est recommandé de capturer d’abord les sphéroïdes, puis de faire tomber l’agarose (c’est-à-dire en inversant l’ordre des points 1.2.9 et 1.2.10).
   9. Faites une goutte de gel d’agarose sur une lame de microscope. Placez la lame sur un bloc chauffant chaud pour éviter que l’agarose ne se solidifie.
   10. À l’aide de la pointe de pipette modifiée (étape 1.2.8), attrapez autant de sphéroïdes que possible dans un volume de 15 à 20 μL.
   11. Injectez avec précaution le 1X PBS contenant du sphéroïde de 15 à 20 μL au centre de la goutte de gel d’agarose sans toucher la lame de microscope.
       note: C’est un point un peu difficile. Les sphéroïdes seront perdus si la pointe de la pipette touche la lame du microscope lors de l’injection des sphéroïdes dans la goutte de gel. Il est conseillé de pratiquer l’ensemble du processus de fabrication de la goutte d’agarose et d’injection des sphéroïdes en injectant un liquide coloré dans la goutte. Cela permettra de visualiser une pénétration potentielle à travers la goutte, car le liquide coloré s’échappera sur la lame.
   12. Laissez le gel d’agarose durcir en l’incubant pendant 5 à 10 min à RT ou à 4 °C. Une fois que la goutte de gel s’est quelque peu solidifiée (mais qu’elle est encore assez molle), poussez soigneusement la goutte de gel de la lame du microscope dans une cassette de tissu en plastique à l’aide d’un scalpel.
   13. Recouvrez les cassettes de tissu plastique d’éthanol à 70 %.
       note: À ce stade, les sphéroïdes peuvent être utilisés directement ou stockés pendant des mois.
   14. Incorporer le sphéroïde inclus dans l’agarose dans de la paraffine, sectionner en lames de couche de 2 à 3 μm d’épaisseur et colorer à l’hématoxyline et à l’éosine ou le soumettre à une coloration immuno-histologique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bactoagar	BD Biosciences	Réf. 214010	Utilisé pour la préparation de gel d’agarose
Formaldéhyde	Produits chimiques VWR	Référence 9713.1000	Utilisé pour la fixation cellulaire
Casette Medim Uni-safe	Medim Histotechnologie	Référence 10-0114	Utilisé pour le stockage de sphéroïdes encastrés
Glissière d’adhérence Superfrost Ultra-Plus	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Lame de verre de microscope utilisée pour l’enrobage
CellTiter-Glo Essai 3D de viabilité cellulaire	Promega	#G9681	Utilisé pour le test de viabilité cellulaire