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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la matrice extracellulaire de la langue (MET)
- Exécutez les souris par luxation cervicale et retirez les langues à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et d’une pince à épiler.
- Immergez les langues dans de l’éthanol à 75 % pendant 3 minutes, puis placez chaque langue dans un tube Eppendorf (EP) de 1,5 mL avec 1 mL de solution tamponnée au phosphate stérile (PBS) de 10 mM.
note: La concentration de PBS dans toutes les étapes suivantes est la même que la concentration dans cette étape.
- Lyse cellulaire par congélation-décongélation : Congelez les langues dans des tubes EP à -80 °C pendant 1 h, puis décongelez les langues à température ambiante pendant 45 min pendant 3 cycles.
- Chargez chaque langue sur un morceau de suture chirurgicale à l’aide d’une aiguille chirurgicale et enveloppez l’extrémité de la suture avec un petit morceau de papier d’aluminium stérile. Effectuer l’opération dans une boîte de culture de 3,5 cm ou 6 cm contenant 75 % d’éthanol dans des conditions stériles.
note: La longueur appropriée de chaque morceau de suture chirurgicale est d’environ 20 cm, et la taille appropriée de chaque morceau de papier d’aluminium est d’environ 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). La langue doit être chargée près du papier d’aluminium.
- Rincer chaque langue avec 3 mL de PBS stérile dans une boîte de culture de 3,5 cm ou 6 cm pendant 30 s. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Lavez les langues avec de l’eau ultrapure : Ajoutez de l’ampicilline dans une bouteille à large goulot avec 250 ml d’eau ultrapure stérile jusqu’à une concentration finale de 90 μg/mL. Mettez les langues dans le flacon contenant un agitateur. Serrez le bouchon du flacon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
note: Jusqu’à 5 langues peuvent être mises dans le même flacon en considération de l’enroulement de la suture. Le papier d’aluminium se trouve à l’extrémité de la suture dans le flacon pour éviter que la langue ne glisse. Les langues doivent être placées à 2 cm de hauteur du fond du flacon en ajustant la longueur de la suture restant à l’intérieur du flacon. Cette note concerne également les étapes 1.8, 1.10, 1.12 et 1.16.
- Mettez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 12 h.
- Laver les langues avec du NaCl : Ajouter de l’ampicilline dans un flacon à large goulot contenant 250 ml de NaCl stérile de 1 M jusqu’à une concentration finale de 90 μg/mL. Déplacez les langues et la barre d’agitation dans la bouteille. Serrez le bouchon du flacon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
- Mettez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Lyse cellulaire par Triton X-100 : Ajouter de l’ampicilline à une concentration finale de 90 μg/mL dans une bouteille à large goulot contenant 250 mL de Triton X-100 stérile à 2 % dans du PBS. Déplacez les langues et la barre d’agitation dans la bouteille. Serrez le bouchon du flacon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
- Mettez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 48 h.
- Laver les langues avec du CaCl2/MgCl2 : Ajouter de l’ampicilline dans un flacon à col large contenant 250 mL de CaCl2/MgCl2 stérile de 5 mM jusqu’à une concentration finale de 90 μg/mL. Déplacez les langues et la barre d’agitation dans la bouteille. Serrez le bouchon du flacon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
- Mettez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Digestion par DNase : Ajouter 1 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans chaque tube EP. Ajouter la DNase dans le HBSS respectivement jusqu’à une concentration finale de 300 μM. Déplacer chaque langue dans chaque tube EP, avec une partie de la suture à l’extérieur du tube. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
note: Assurez-vous que la partie de la suture qui reste à l’intérieur des biberons dans les étapes précédentes reste également à l’intérieur du tube EP dans cette étape, et assurez-vous que la partie de la suture qui reste à l’extérieur des biberons dans les étapes précédentes reste également à l’extérieur du tube EP dans cette étape.
- Incuber les languettes dans des tubes EP à 37 °C pendant 24 h.
- Laver les langues avec du PBS : Ajouter de l’ampicilline dans un flacon à large goulot contenant 250 ml de PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 90 μg/mL. Déplacez les langues et la barre d’agitation dans la bouteille. Serrez le bouchon du flacon avec une partie de la suture restant à l’extérieur du flacon. Effectuez cette opération dans des conditions stériles.
- Mettez la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Conserver le MET préparé dans du PBS stérile à 4 °C jusqu’à utilisation.