Cryobroyage de tissus décellularisés : une technique pour obtenir de fines poudres de matrice extracellulaire

Résumé

Source : Kornmüller, A. et al. Fabrication de mousses et de microtransporteurs dérivés de la matrice extracellulaire en tant que plateformes de culture et de livraison de cellules spécifiques aux tissus. J. Vis. Exp. (2017)

Dans cette vidéo, nous présentons le protocole permettant d’obtenir une poudre de matrice extracellulaire finement broyée à partir de tissu décellularisé lyophilisé par cryobroyage. L’ECM en poudre conserve sa composition biochimique et peut être utilisé pour la synthèse de microsupports.

Protocole

1. Traitement des tissus décellularisés

1. Décellularisation et lyophilisation
   1. Décellulariser le(s) tissu(s) d’intérêt en suivant un protocole établi.
      note: Les échafaudages de la présente étude ont été préparés conformément aux protocoles de décellularisation publiés pour le TED humain, le DDT porcin et le DLV porcin. Disponible dans le commerce, le collagène insoluble peut également être utilisé pour fabriquer des mousses et des microsupports, tels que le collagène provenant du tendon bovin, qui a été utilisé avec succès sur une plage de concentration de 10 à 50 mg / mL. D’autres sources de collagène insolubles peuvent être utilisées, mais peuvent nécessiter une optimisation pour identifier la plage de concentration qui produira des échafaudages stables.
   2. Transférez le tissu décellularisé hydraté ou le collagène purifié dans un tube à centrifuger de 50 mL à l’aide d’une pince et ajoutez suffisamment d’eau doublement distillée (ddH₂O) pour immerger le tissu, jusqu’à un volume total maximal de 35 mL.
   3. Congelez l’échantillon pendant la nuit à -80 °C, le tube à centrifuger étant positionné horizontalement pendant la congélation afin de maximiser la surface de sublimation lors de la lyophilisation ultérieure.
   4. Retirez le capuchon du tube à centrifuger et transférez l’échantillon congelé dans un bocal de lyophilisation.
   5. Lyophilisez l’échantillon à l’aide d’un lyophilisateur de laboratoire pendant 48 à 72 h ou jusqu’à ce qu’il soit complètement sec.
      note: Le temps de séchage peut varier selon les lyophilisateurs et les tissus décellularisés.
   6. Hachez finement l’ECM lyophilisée en petits morceaux (~ 1–2 mm³) à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants.
   7. Conservez l’ECM haché dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour un traitement ultérieur.
      note: Il est recommandé d’utiliser immédiatement l’ECM haché pour éviter l’absorption d’humidité de l’environnement.
2. Cryobroyage (en option pour la fabrication de mousse)
   1. Remplissez une chambre de broyage en acier inoxydable de 25 ml pour un système de broyage à boulets de laboratoire avec ECM lyophilisé haché et ajoutez deux billes de broyage en acier inoxydable de 10 mm.
   2. Fermez et immergez complètement la chambre de broyage chargée dans de l’azote liquide pendant 3 min.
   3. Broyez l’échantillon congelé pendant 3 min à 30 Hz (1 800 tr/min).
   4. Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 jusqu’à ce que l’ECM soit broyé en une poudre fine.
      note: Le nombre de fois que ces étapes doivent être répétées peut varier d’une source ECM à l’autre. Par exemple, le DAT nécessite généralement 3 cycles de broyage pour générer une poudre fine.
   5. Transférez la poudre à l’aide d’une cuillère dans un flacon en verre, fermez hermétiquement et conservez-la dans un dessiccateur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fils à pince crocodile	VWR	Référence 470149-728
Aluminium	Fisher Scientific	Tél. : 01-213-101
Balance analytique	Sartorius	CPA225D
Système de cryobroyage	Retsch	Référence 20.745.0001	MM 400
Dessicateur	Fisher Scientific	8624426	Pour le stockage lyophilisé de l’ECM et des bioéchafaudages
Fiole de Dewar	Fisher Scientific	Référence 10-196-6	Forme basse ; plage de volume de 250 à 500 ml
Eau double distillée (ddH2O)			Du système de purification d’eau Barnstead GenPure xCAD
ECM (matrice extracellulaire)			Isolé à partir de tissu adipeux humain, de derme porcin ou de myocarde porcin, tel que décrit dans Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 et Wainwright et al. 2010
forceps	VWR	Référence 37-501-32	Pour le transfert des mousses
Congélateur (-20 °C)	VWR	Référence 97043-346
Congélateur ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Flacons en verre	Fisher Scientific	Tél. : 03-339-26D	Pour stocker l’ECM cryomillée lyophilisée
azote liquide			Pour l’électropulvérisation
Lyophilisateur	Labconco	7750021	Zone Libre4.5
Chambre de broyage	Retsch	Tél. : 02.462.0213	Volume recommandé de 25 mL
Broyage de billes	VWR	16003 à 606	Diamètre 10 mm, acier inoxydable recommandé
Pénicilline-streptomycine	Technologies de la vie	Référence 15140-122	Utilisé pour les milieux de prolifération
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Scoopula	VWR	Référence 89259-968	Pour la collecte des microsupports
Ciseaux chirurgicaux	VWR	Référence 82027-590