Préparation de suspension ECM : une technique pour obtenir une suspension homogène à partir d’une matrice extracellulaire dérivée de tissus

Résumé

Source : Kornmuller, A. et al. Fabrication de mousses et de microtransporteurs dérivés de la matrice extracellulaire en tant que plateformes de culture et d’administration de cellules spécifiques aux tissus. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo décrit la préparation d’une suspension de matrice extracellulaire homogénéisée et digérée à partir de tissus décellularisés et lyophilisés. Cette technique permet de fabriquer des mousses poreuses et des microsupports dérivés de l’ECM pour les utiliser comme substrats dans des modèles de culture cellulaire 3D avancés.

Protocole

1. Traitement des tissus décellularisés

1. Décellularisation et lyophilisation
   1. Décellulariser le(s) tissu(s) d’intérêt en suivant un protocole établi.
      note: Les échafaudages de la présente étude ont été préparés conformément aux protocoles de décellularisation publiés pour le tissu adipeux décellularisé humain (DAT), le tissu dermique décellularisé porcin (DDT) et le ventricule gauche décellularisé porcin (DLV). Disponible dans le commerce, le collagène insoluble peut également être utilisé pour fabriquer des mousses et des microsupports, tels que le collagène provenant du tendon bovin, qui a été utilisé avec succès sur une plage de concentration de 10 à 50 mg / mL. D’autres sources de collagène insolubles peuvent être utilisées, mais peuvent nécessiter une optimisation pour identifier la plage de concentration qui produira des échafaudages stables.
   2. Transférez le tissu décellularisé hydraté ou le collagène purifié dans un tube à centrifuger de 50 mL avec une pince et ajoutez suffisamment d’eau double distillée (ddH₂O) pour immerger le tissu, jusqu’à un volume total maximal de 35 mL.
   3. Congelez l’échantillon pendant la nuit à -80 °C, le tube à centrifuger étant positionné horizontalement pendant la congélation afin de maximiser la surface de sublimation lors de la lyophilisation ultérieure.
   4. Retirez le capuchon du tube à centrifuger et transférez l’échantillon congelé dans un bocal de lyophilisation.
   5. Lyophilisez l’échantillon à l’aide d’un lyophilisateur de laboratoire pendant 48 à 72 h ou jusqu’à ce qu’il soit complètement sec.
      note: Le temps de séchage peut varier selon les lyophilisateurs et les tissus décellularisés.
   6. Hachez finement l’ECM lyophilisée en petits morceaux (~1–2 mm³) à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants.
   7. Conservez l’ECM haché dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour un traitement ultérieur.
      note: Il est recommandé d’utiliser immédiatement l’ECM haché pour éviter l’absorption d’humidité de l’environnement.
2. Cryobroyage
   1. Remplissez une chambre de broyage en acier inoxydable de 25 ml pour un système de broyage à boulets de laboratoire avec ECM lyophilisé haché et ajoutez deux billes de broyage en acier inoxydable de 10 mm.
   2. Fermez et immergez complètement la chambre de broyage chargée dans de l’azote liquide pendant 3 min.
   3. Broyez l’échantillon congelé pendant 3 min à 30 Hz (1 800 tr/min) en une poudre fine.
      note: Le nombre de fois que ces étapes doivent être répétées peut varier d’une source ECM à l’autre. Par exemple, le DAT nécessite généralement 3 cycles de broyage pour générer une poudre fine.
3. Préparation de la suspension ECM
   1. Pesez 250 mg d’ECM haché (pour les mousses) ou cryobroyé (pour les mousses ou les microsupports) et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml. Se référer à l’étape 1.1.6 et à la section 1.2 pour la préparation de l’ECM haché et de l’ECM cryobroyé, respectivement.
      note: Ce protocole est conçu pour préparer une suspension ECM de 50 mg/mL, ce qui est recommandé pour le TED humain, le DDT porcin et le DLV porcin. En fonction de la source ECM spécifique, des suspensions uniformes peuvent être générées à des concentrations de départ plus ou moins élevées.
   2. Ajoutez 5 ml de tampon 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) dans le tube à centrifuger et marquez le niveau de liquide sur le tube.
   3. Préparez une solution mère de α-amylase en ajoutant 7,5 mg de α-amylase à 1 mL de tampon 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4). Ajouter 100 μL de la solution mère de α-amylase (0,75 mg de α-amylase : 0,3 % p/p de tissu sec) à l’échantillon. Ajouter 0,22 M NaH₂PO₄ pour obtenir un volume final de 10 mL.
   4. Agitez la suspension en continu à 300 tr/min pendant 72 h à température ambiante.
   5. Centrifugez la suspension à 1 500 x g pendant 10 min. Récupérez et jetez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille ECM digérée. Remettre en suspension la matière granulée dans 10 mL de NaCl à 5 % dilué dans du jdH₂O.
   6. Répétez l’étape 1.3.5 pour un total de deux rinçages avec 5 % de NaCl dans_jj-2O.
   7. Jeter le surnageant et remettre en suspension la matière granulée dans 10 mL de ddH₂O.
   8. Agitez la suspension en continu à 300 tr/min pendant 10 min à RT.
   9. Centrifugez la suspension à 1 500 x g pendant 10 min. Récupérez et jetez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille ECM digérée.
   10. Ajouter 0,2 M d’acide acétique au repère de 5 mL effectué à l’étape 1.3.2.
   11. Agitez la suspension en continu à 120 tr/min O/N à 37 °C.
   12. Homogénéisez la suspension ECM à température ambiante toutes les 10 secondes à l’aide d’un homogénéisateur portatif équipé d’une sonde en dents de scie de 10 mm de large jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fragments visibles. Placez la suspension dans un bécher d’eau froide entre les intervalles d’homogénéisation pour éviter la surchauffe.
       note: Selon la source ECM, une dilution supplémentaire dans de l’acide acétique 0,2 M peut être nécessaire pour obtenir une suspension homogène. Un refroidissement excessif de la suspension ECM peut entraîner une augmentation de la viscosité qui peut interférer avec une homogénéisation efficace. Si une augmentation de la viscosité est constatée, l’échantillon peut être réchauffé à 37 °C et soumis à un traitement supplémentaire.
   13. Conserver à 4 °C jusqu’à un mois avant la fabrication de mousse ou de microsupport.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique glacial	Boutique Bio	ACE222.5
α-amylase	sigma	101074694	d’Aspergillus aryzae
Centrifugeuse 75004251	Thermo Scientific		Avec rotor à godets oscillants pour tubes à centrifuger de 15 et 50 mL
Tubes à centrifuger (15 ml)	Sarstedt	Référence 62.554.205
Dessicateur	Fisher Scientific	8624426	Pour le stockage lyophilisé de l’ECM et des bioéchafaudages
Eau double distillée (ddH2O)			Du système de purification d’eau Barnstead GenPure xCAD
ECM (matrice extracellulaire)			Isolé à partir de tissu adipeux humain, de derme porcin ou de myocarde porcin, tel que décrit dans Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 et Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Homogénéisateur à main	Fisher Scientific	Tél. : 14-359-251	Vitesse : 8 000 - 30 000 tr/min
Accessoires d’homogénéisateur : sondes de générateur de fond en dents de scie	Fisher Scientific	Tél. : 14-261-17	10 x 95 millimètre
azote liquide
chlorure de sodium	Boutique Bio	Référence 7647-14-5
Phosphate de sodium monobasique	Boutique Bio	Référence 10049-21-5
Ciseaux chirurgicaux	VWR	Référence 82027-590