Fabrication de mousse dérivée d’une matrice extracellulaire par lyophilisation : une procédure pour générer des échafaudages biologiques à partir de la MEC de tissus décellularisés

Résumé

Source : Kornmüller, A. et al. Fabrication de mousses et de microtransporteurs dérivés de la matrice extracellulaire en tant que plateformes de culture et d’administration de cellules spécifiques aux tissus. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo décrit la méthode de synthèse de mousses pures dérivées de l’ECM sans avoir besoin de réticulation chimique. Ces mousses dérivées de l’ECM trouvent des applications en tant que modèles de culture cellulaire in vitro 3D avancés ou en tant que bioéchafaudages pro-régénératifs.

Protocole

1. Fabrication de mousse dérivée de l’ECM

1. Préparez la suspension ECM homogène en dispersant la poudre fine ECM dans une solution tampon et incubez à 37 °C avec une agitation continue à 120 tr/min jusqu’à ce que la suspension soit chaude.
2. Diluer la suspension ECM dans de l’acide acétique 0,2 M à la concentration souhaitée.
   note: Selon la source ECM, des mousses stables peuvent être préparées dans la plage de 10 à 100 mg/mL, avec 15 à 50 mg/mL comme plage recommandée pour DAT, DDT et DLV. En règle générale, les mousses fabriquées à des concentrations plus élevées seront légèrement moins poreuses, mais plus stables en culture et plus faciles à manipuler.
3. À l’aide d’une seringue de 3 ml avec une aiguille de 18G pour éviter la formation de bulles dans la suspension ECM, remplissez le moule souhaité avec la suspension ECM. Pour fabriquer les mousses DAT, DDT et DLV, versez 400 μL de suspension ECM à 35 mg/mL dans une plaque traitée par culture cellulaire à 48 puits.
   note: La forme du moule sélectionné et le volume de la suspension ECM détermineront la géométrie de la mousse résultante.
4. Couvrez et congelez les moules pendant la nuit en les plaçant dans un congélateur à -20 °C ou -80 °C.
   note: La température de congélation peut affecter la porosité des mousses. Des pores plus grands sont attendus lorsque les échantillons sont congelés à -20 °C contre -80 °C en raison de la formation de cristaux de glace plus gros. Pour fabriquer des mousses avec une structure poreuse uniforme, assurez-vous que le moule n’est pas en contact avec une surface conductrice afin d’éviter le refroidissement directionnel.
5. Placez les moules contenant les échantillons congelés dans une fiole de lyophilisateur. Connectez la fiole de lyophilisation au système de lyophilisateur de laboratoire et séchez-la pendant 24 h
   REMARQUE : Il est important que l’échantillon reste congelé avant la lyophilisation.
6. Conservez les mousses lyophilisées dans un dessiccateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Balance analytique	Sartorius	CPA225D
Tubes à centrifuger (15 ml)	Sarstedt	Référence 62.554.205
Tubes à centrifuger (50 mL)	Sarstedt	Référence 62.547.205
Collagène d’Achille bovin tendon (insoluble)	sigma	Réf. C9879	Ou similaire insoluble collagen source; Peut être utilisé comme un Alternative à la décellularisation tissus pour fabriquer les mousses et Microporteurs
Dessicateur	Fisher Scientific	8624426	Pour ECM lyophilisé et Stockage en bio-échafaudage
Fiole de Dewar	Fisher Scientific	Référence 10-196-6	Forme basse ; plage de volume de 250 à 500 mL
Eau double distillée (ddH_{2} O)			De Barnstead GenPure xCAD Système de purification de l’eau
D-PBS (tamponné au phosphate Saline)	bison d’europe	311425125
ECM (matrice extracellulaire)			Isolé de l’adipeux humain tissu, derme porcin ou porcin myocarde, tel que décrit dans Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, et Wainwright et al. 2010 (réf. # 28, 8, 32)
forceps	VWR	Référence 37-501-32	Pour le transfert des mousses
Congélateur (-20 °C)	VWR	Référence 97043-346
Congélateur ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Flacons en verre	Fisher Scientific	Tél. : 03-339-26D	Pour stocker cryomillé lyophilisé Ecm
azote liquide			Pour l’électropulvérisation
Lyophilisateur	Labconco	7750021	Zone Libre4.5
Aiguille 18 G	VWR	C ABD305185	Pour la distribution de suspension ECM dans des moules
Agitateur d’incubateur orbital	SciLogex	832010089999	Température contrôlée (37 °C)
Pipettes sérologiques (10 mL)	Sarstedt	Référence 86.1254.001
Pipettes sérologiques (25 mL)	Sarstedt	Référence 86.1685.001
chlorure de sodium	Boutique Bio	Référence 7647-14-5
Phosphate de sodium monobasique	Boutique Bio	Référence 10049-21-5