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1. Fabrication de microsupports dérivés de l’ECM par électropulvérisation
REMARQUE : La figure 1 présente une vue d’ensemble de la configuration de l’électropulvérisation.
- Incuber une suspension ECM cryobroyée préalablement préparée à 37 °C avec agitation continue à 100 tr/min O/N.
note: L’ECM cryomillé est utilisé pour fabriquer les microsupports dérivés de l’ECM afin d’assurer une plus grande uniformité de la suspension et d’éviter le colmatage lors de l’électropulvérisation.
- Chargez 3 ml de suspension ECM dans une seringue Luer-Lock de 3 ml et fixez un ensemble de perfusion à oreilles sur l’alésage de la seringue.
note: Une gamme de calibres d’aiguille peut être utilisée, en reconnaissant que la sélection peut influencer la taille et la forme des microsupports résultants. Pour fabriquer les microsupports DAT, DDT et DLV, utilisez une aiguille 25G.
- Fixez la seringue à l’intérieur du pousse-seringue. Fixez l’aiguille à un support d’autoclave et positionnez la pointe de l’aiguille verticalement à une distance de 4 à 6 cm du haut d’une fiole de Dewar de forme basse (taille de 250 à 500 ml recommandée).
- Fixez une électrode crocodile à la pointe de l’aiguille et connectez-la à la borne positive de l’alimentation haute tension.
- Pliez une bande de papier d’aluminium (12 x 5 cm) sur le bord de la bouteille isotherme.
- Fixez une deuxième électrode à pince crocodile sur le bord extérieur de la feuille et connectez-la à la borne de terre de l’alimentation.
- Remplissez la fiole de Dewar avec de l’azote liquide jusqu’à environ 1 cm du haut, de sorte que les 3/4 de la feuille soient immergés.
note: Il est important de garder la fiole de Dewar remplie d’azote liquide. La surface de l’azote liquide ne doit pas être à moins de 2 cm du haut du ballon pendant le processus d’électropulvérisation. Un remplissage continu de l’azote liquide est nécessaire pour maintenir un niveau constant pendant l’électropulvérisation.
- Réglez le pousse-seringue à un débit de perfusion de 30 mL/h.
note: La variation du débit de perfusion peut modifier la forme et le diamètre du microporteur, mais la plage recommandée est de 25 à 35 ml/h. Bien qu’il dépende fortement de la viscosité de la suspension, des débits inférieurs à 25 mL/h peuvent entraîner la génération de microporteurs plus grands. À des débits très faibles, la taille et la forme des microsupports peuvent devenir moins homogènes. À des débits de perfusion supérieurs à 35 mL/h, l’uniformité des gouttelettes générées par l’électropulvérisation peut être perturbée, ce qui donne des microporteurs non sphériques avec une distribution de taille plus large.
- Appliquez une tension de 20 kV et allumez la pompe à seringue pour lancer l’électropulvérisation.
note: La tension peut être modifiée pour s’adapter à la taille des microporteurs et a tendance à avoir un impact plus important sur le diamètre que le débit de perfusion. La plage de tension recommandée est de 15 à 25 kV. Une diminution du diamètre des microporteurs est attendue avec une augmentation de la tension.
- Une fois la perfusion terminée, versez soigneusement l’excès d’azote liquide du Dewar, en laissant les microtransporteurs en suspension dans ~25 mL d’azote liquide pour vous assurer qu’ils restent congelés.
- Transférez immédiatement les microsupports contenant l’azote liquide dans un tube à centrifuger de 50 ml en versant en un seul mouvement fluide. Récupérez tous les microsupports congelés qui restent dans le Dewar à l’aide d’une cuillère et ajoutez-les dans le tube à centrifuger.
note: Selon la taille du Dewar, les microporteurs d’azote liquide peuvent être initialement versés dans un récipient de taille moyenne, puis transférés immédiatement dans le tube à centrifuger de 50 ml.
- Recouvrez le tube de centrifugation contenant les microsupports d’azote liquide avec une feuille d’aluminium perforée de petits trous en préparation de la lyophilisation.
- Placez les tubes à centrifuger couverts dans une fiole de lyophilisateur. Raccorder immédiatement la fiole au lyophilisateur et sécher les échantillons O/N.
note: Il est très important de garder les microtransporteurs en suspension dans de l’azote liquide pour s’assurer qu’ils ne dégèlent pas avant cette étape, car la décongélation peut entraîner un effondrement et/ou une agrégation. Les microtransporteurs DAT, DDT et DLV fabriqués à une concentration de 35 mg/mL dans les conditions d’électropulvérisation décrites ci-dessus auront généralement un diamètre hydraté variant entre 350 et 500 μm. La distribution de la taille peut varier en fonction de la source ECM.
- Conservez les microsupports lyophilisés dans un dessiccateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin.