Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des gouttelettes matricielles semi-solides (< 1 min par plaque)
- Placez une plaque inférieure en verre pré-refroidie sur un bloc de glace sous le microscope opératoire. Assurez-vous que l’aliquote de la matrice reste sur la glace en tout temps.
- Placez une gouttelette de matrice de 1,5 μL dans chacun des quatre coins de la plaque à fond de verre avec une micropipette de 2 μL ou 10 μL, en laissant une distance au moins aussi grande que la gouttelette elle-même par rapport au bord du puits en verre.
- Placez l’extrémité de la pipette directement sur le verre à un angle de 45 degrés. Pipetez lentement la matrice. Éloignez-vous lentement du fond du verre une fois que la matrice est engagée sur la plaque.
note: La tension superficielle entre la matrice et le verre doit créer un hémisphère parfait à chaque fois.
- Arrêtez le pipetage juste avant que la pointe ne soit vide, car l’injection d’air par inadvertance dans la gouttelette de matrice augmente considérablement le diamètre de la gouttelette de la matrice et est difficile à éliminer.
note: L’utilisation d’une seconde main pour stabiliser la main de pipetage facilite un placement plus précis.
2. Insertion de DRG dans des gouttelettes matricielles semi-solides (< 2 min par plaque)
- Laissez brièvement la plaque avec les gouttelettes matricielles à température ambiante (~1 min). Cela rigidifie légèrement la matrice, ce qui facilite le placement précis du DRG.
- Retirez (ne saisissez pas) le DRG doucement avec une pince microscopique fermée dans la main gauche. Là encore, un fond sombre sur le petit DRG blanc facilite la visualisation. Transférez le DRG à la pointe d’une aiguille 21G dans la main droite. Ce transfert laissera du milieu résiduel sur la pince.
- Insérez délicatement le DRG au milieu de la gouttelette matricielle à l’aide de l’aiguille 21G (Figure 1). La plupart du temps, le DRG se libère facilement dans la matrice et peut ensuite être positionné au centre avec l’aiguille.
- Si le DRG colle à l’aiguille, utilisez la pince microscopique pour pousser le DRG hors de l’aiguille et dans la gouttelette de la matrice. Évacuez l’excès de support de la pince microscopique à l’aide d’une lingette de laboratoire.
note: L’introduction de milieux dans la matrice modifiera le diamètre, le volume et la consistance du dosage. Un bloc de glace avec une écriture colorée ou en couleur fournit un contraste d’arrière-plan, ce qui facilite la visualisation de ce processus délicat.
- Une fois que la plaque a les quatre DRG, effectuez une inspection finale pour vous assurer que le DRG est au centre de la gouttelette de matrice. Faites les ajustements nécessaires avec l’aiguille 21G.
- Transférez la plaque terminée dans un incubateur à 37 °C. Cela solidifiera la matrice semi-solide et fixera le DRG en position.
- Répétez ce processus pour tous les DRG. Placez des gouttelettes matricielles vierges sans DRG comme contrôle négatif.
- Ajouter 4 ml de DMEM avec un média à 10 % FBS dans chaque plaque à fond de verre après avoir terminé toutes les plaques et les avoir exposées à l’incubateur à 37 °C pendant au moins 3 min. Placez la plaque légèrement inclinée et ajoutez lentement le fluide, de sorte qu’il entre progressivement en contact avec les unités matrice-DRG.
note: Si le milieu est ajouté trop rapidement ou trop vigoureusement, la matrice et/ou le DRG peuvent se déloger.
- Conservez les dosages dans l’incubateur à 37 °C pendant les prochaines 48 à 72 h
note: L’examen périodique des dosages montrera une excroissance circonférentielle des neurites vers le bord de la matrice (Figure 2). Lorsque les neurites sont à plus des trois quarts du chemin vers la matrice, il convient de plaquer les cellules.
3. Préparation des cellules cancéreuses de la tête et du cou
REMARQUE : Des lignées cellulaires autres que les cellules de carcinome épidermoïde de la tête et du cou peuvent être utilisées dans ce plan expérimental.
- Conservez les lignées cellulaires de carcinome épidermoïde dans du DMEM avec 10 % de FBS dans les flacons ou les boîtes de culture préférés dans un incubateur à 37 °C. Pour préparer les cellules à l’expérimentation, aspirez tout le milieu du ballon de culture ou de la parabole et lavez-le deux fois avec du PBS. Mettez les cellules en suspension en ajoutant une quantité appropriée de trypsine à 0,025 % pendant 5 min, suivie de DMEM avec 10 % de FBS. Pipeter 4 mL du mélange de cellules et de milieux dans des boîtes de culture de 6 mL.
note: Une plaque de culture de 6 mL fournit plus qu’assez de cellules, même lorsqu’elles sont confluentes à moins de 50 %.
- Exposer les lignées cellulaires HNSCC à différentes conditions 24 h avant la coloration et le placage sur le test DRG. Redosez la condition une fois que les cellules sont conditionnées pour maintenir un environnement cohérent.
note: Ajoutez des anticorps, des facteurs de croissance, des cytokines ou d’autres molécules dans les boîtes de culture cellulaire 1 à 2 jours après la dissection de la souris et l’implantation du DRG dans la matrice.
- Ajouter des colorants cellulaires fluorescents 1 h avant de plaquer les cellules (2 à 3 jours après la récolte du DRG et l’implantation dans la matrice).
note: Les colorants particuliers utilisés ici passent librement à travers la membrane cellulaire ; Cependant, après avoir réagi avec les groupes thiols intracellulaires, la coloration reste à l’intérieur de la cellule et est transmise aux cellules filles. La coloration facilite grandement la visualisation dans les dosages. Ces colorations temporaires sont idéales pour ces tests car la fluorescence est présente pendant 2 à 3 jours, ce qui correspond à la durée de ces expériences. Il permet également d’utiliser de nombreuses couleurs différentes et évite d’avoir à créer des lignées cellulaires transfectées par des protéines fluorescentes.
- Préparez 10 μM de solution de colorant en mélangeant 2 μL de colorants de cellules mères de 10 mM dans 2 ml de DMEM sans sérum pour chaque condition cellulaire. Réchauffez-le à 37 °C avant de l’ajouter aux cellules.
- Retirer le milieu de culture à l’intérieur de la plaque de 6 mL, en laissant les cellules HNSCC adhérentes sur la plaque. Ajouter 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et retirer 2 ml de DMEM sans colorant cellulaire de 10 μM/sérum ajouté à chaque plaque.
- Remettre la plaque de culture de 6 mL avec la coloration cellulaire dans l’incubateur à 37 °C pendant 40 min.
- Au bout de 40 min, aspirez le milieu. Ajoutez 2 ml de PBS puis aspirez-le. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,025 % dans chaque plaque et les remettre dans l’incubateur à 37 °C.
- Ajoutez 2 ml de DMEM avec 10 % de FBS après 3 à 5 minutes et transférez les cellules en suspension dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner les cellules et mettez-les en suspension dans 1 mL de DMEM avec 10 % de FBS.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé, puis ajoutez du DMEM avec 10 % de FBS pour créer une concentration cellulaire finale de 300 000 cellules par ml.
4. Placage des cellules cancéreuses de la tête et du cou
- Retirez les plaques à fond de verre avec les dosages Matrix-DRG de l’incubateur.
note: Encore une fois, ils sont appropriés lorsque les neurites sont à au moins 75 % du bord de la matrice, ce qui se produit généralement après 2 à 3 jours. Il est préférable de le voir en utilisant au moins un objectif 10X.
- Aspirez le fluide à l’intérieur de la plaque à fond de verre. Aspirez complètement le fluide à l’intérieur du puits de verre sans retirer les unités matricielles-DRG.
- Prélevez 200 μL du milieu à 300 000 cellules/mL à l’aide d’une pipette de 200 μL. Placez deux gouttes des cellules sur chaque dosage de la matrice-DRG. Effectuez cette étape pour chaque gouttelette de matrice, en créant quatre répétitions de chaque condition cellulaire sur une plaque.
note: La forme hémisphérique de la matrice permet aux cellules de s’installer dans un anneau le long de la périphérie du test (Figure 3a, Figure 3b). Trouver une pipette avec une gâchette lisse facilite grandement le placement de gouttes uniformes.
- Confirmez des nombres de cellules similaires et la distribution des différentes conditions cellulaires au microscope 4X.
- Placez les plaques à fond de verre dans l’incubateur à 37 °C pendant environ 60 min
note: Bien qu’il n’y ait qu’un petit volume de cellules et de milieux (~150 μL), les tests ne sèchent pas avant que plusieurs heures d’incubation ne se soient écoulées.
- Après 60 min, ajoutez délicatement 4 ml de DMEM avec 10 % de FBS le long de la paroi latérale de la plaque à fond de verre.
note: Au fil du temps, les cellules adhèrent partiellement au fond de la plaque et la méthode d’ajout du milieu ne perturbe pas les cellules. Différents types de cellules peuvent prendre plus ou moins de temps pour commencer à adhérer à la plaque à fond de verre.
- Remplacez tout médicament exogène ou facteur de croissance à ce moment pour maintenir les niveaux de concentration précédents.
- Remettre les dosages dans l’incubateur à 37 °C, sauf lorsqu’ils sont examinés au microscope. Quantifier les résultats de ce test par imagerie microscopique. Brièvement, comptez les brins d’invasion périneurale dans quatre quadrants à l’aide d’une image microscopique 4X.
note: Un microscope doté d’un objectif 4X et de capacités de fluorescence est adéquat pour photodocumenter les essais. La taille des tests s’inscrit parfaitement dans le champ d’un objectif 4X, qui est suffisamment détaillé pour capturer les zones individuelles d’invasion périneurale. L’invasion périneurale devient apparente dans les 24 heures, mais au-delà de 48 heures, l’intégrité des tests commence à s’affaiblir, car les cellules tumorales se divisent le long de la périphérie de la matrice et envahissent. Au-delà de 48 h, il y a également un efflux important de fibroblastes du DRG, ce qui obscurcit la visualisation à l’aide de la microscopie à fond clair. Par conséquent, il est conseillé de photo-documenter les résultats avec la microscopie 4X au moins deux fois pendant cette fenêtre (par exemple, 24 et 48 heures après le placage des cellules tumorales). N’oubliez pas qu’il s’agit de tests en 3 dimensions et qu’il est difficile d’imager complètement l’ensemble du test. La plupart des invasions périneurales se produisent dans un plan à partir du bas de la plaque, où les cellules sont intégrées dans la matrice légèrement au-dessus du bas de la plaque. Parce que ce plan est proche de l’horizontale, la grande majorité des neurites avec des cellules tumorales sont capturés dans une image à un seul niveau à 4X.
