1. Sélection d’une population latérale (SP) par le test d’efflux de colorant de Hoechst
- Coloration de 50 millions de cellules avec le colorant Hoechst 33342
- Préparez deux tubes stériles de 15 mL à fond conique : l’un étiqueté « Hoechst » et l’autre étiqueté « Hoechst et Verapamil ». Préparez 10 ml de 5 mM de solution de chlorhydrate de vérapamil dans de l’eau stérile. Préparez le milieu de culture (CM) pour les cellules souches.
- Pour préparer la MC pour le CSC (CM-CSC), combinez les éléments suivants : milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) : F12 (1:3, v :v), 5 % de sérum de veau fœtal (SCF), 0,04 mg/L d'hydrocortisone, 100 U/mL de pénicilline, 0,1 g/L de streptomycine et 20 μg/L de facteur de croissance épidermique (R-EGF).
- Sous une hotte à flux laminaire, trypsinisez les cellules. Retirer le support, laver avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et ajouter 1 mL de trypsine-EDTA (0,5 g/L) pour une fiole de 75 cm². Incuber 3 min à 37 °C. Arrêter la réaction en ajoutant un milieu de culture utilisé pour la lignée cellulaire parentale. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
- Pour préparer la MC pour la lignée cellulaire parentale (CM-P), complétez le DMEM avec 10 % de FCS, 0,4 mg/L d’hydrocortisone, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 g/L de streptomycine.
- Diluer la suspension cellulaire obtenue à l’étape 1.1.2 pour obtenir 107 cellules/mL dans CM-P. Divisez la suspension cellulaire dans les deux tubes préparés : mettez 100 μL (106 cellules) dans le tube « Hoechst et Verapamil » et 4 mL (4 x 107 cellules) dans le tube « Hoechst ».
- Dans l’échantillon « Hoechst et Verapamil », ajoutez 10 μL de 5 mM de solution de chlorhydrate de Verapamil (concentration finale : 0,5 mM) et mélangez délicatement. Ajouter 5 μL de solution Hoechst à 1 g/L (concentration finale : 0,1 g/L). Dans l’échantillon « Hoechst », ajouter 5 μL de solution de Hoechst à 1 g/L pour 106 cellules (200 μl au total). Désormais, conservez les échantillons à l’abri de l’exposition directe à la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.
- Incuber tous les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h 30 min. Mélanger délicatement toutes les 15 min pour éviter que les cellules ne se déposent.
- Tubes à centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille avec 2 mL de 1x PBS.
- Tubes de centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille « Hoechst and Verapamil » dans 500 μL d’iodure de propidium (IP) à 5 mg/L dilué dans un tampon PBS et la pastille « Hoechst » dans 4 mL d’IP à 5 mg/L dilués dans un tampon PBS.
- Transférez les solutions d’échantillons à travers une crépine de cellules de 70 μm pour éliminer les agrégats et collecter des cellules individuelles dans des tubes pour l’absorption de l’échantillon sur le cytomètre en flux. Conservez les échantillons sur de la glace et protégez-les de l’exposition directe à la lumière à l’aide de papier d’aluminium.
2. Isolement de la population latérale à l’exclusion du colorant de Hoechst par tri cellulaire
- Effectuez la séparation cellulaire négative de Hoechst sur un trieur de cytométrie en flux avec les paramètres suivants : laser UV (355 nm), deux détecteurs sur le trajet du laser UV avec des filtres Hoechst bleus (450/50 BP) et rouges Hoechst (610/20 BP), et deux collecteurs.
- Tout d’abord, analysez l’échantillon « Hoechst » qui sert de contrôle positif pour la coloration et la mise en place du cytomètre en flux.
- À l’aide du logiciel de cytomètre, dans la fenêtre « Feuille de travail globale », cliquez sur « Dot Plot » (cinquième image en haut à droite) et créez un graphique sur la feuille de travail globale. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez FSC-A (diffusion directe) et en abscisse, SSC-A (diffusion latérale) (Figure 1A). De la même manière, créez un diagramme à points SSC-W par rapport à SCC-H. Sur ce deuxième graphique à points, pour créer une région P1, cliquez sur « Porte polygonale » (quatorzième image en haut à droite) (Figure 1B).
note: La région P1 englobera des cellules simples et discriminera des doublets.
- Facultatif : Excluez les cellules PI positives en créant un FSC-A par rapport à PI contrôlé sur P1. Sur ce graphique à points, sélectionnez la population PI négative (P2) pour exclure les cellules mortes PI positives.
- À l’aide du logiciel de cytomètre, dans la fenêtre « Feuille de travail globale », cliquez sur « Dot Plot » et créez un graphique sur la feuille de travail globale. En ordonné, avec un clic droit, sélectionnez le bleu Hoechst-A et en abscisse, le rouge Hoechst-A. Avec un clic droit sur la population, sélectionnez « Afficher la population » et P1. Sur ce graphique à points, créez une région (P2) pour sélectionner les cellules négatives de la population latérale du colorant Hoechst (SP) qui apparaissent comme un bras latéral à gauche de la population principale de cellules (Figure 1C).
- Analysez l’échantillon « Hoechst » et collectez 10 000 événements. Pour s’assurer que la porte P2, qui représente la population SP, est bien positionnée, analysez l’échantillon « Hoechst et Verapamil » (10 000 événements) pour observer la disparition de la population SP (Figure 1D).
- Prélever les cellules négatives de colorant SP Hoechst dans un tube de 15 mL contenant 1 mL de CM-CSC préparé à l’étape 1.1.1.
- À la fin du tri des cellules, centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 1 mL de CM-CSC. Compter le nombre de cellules triées à l’aide d’un compteur de cellules et transférer un nombre approprié de cellules dans une fiole de culture (voir le tableau 1). Ajouter le CM-CSC et incuber à 37 °C et 5 % deCO2 dans une atmosphère.
- Maintenir les cellules en culture dans les mêmes conditions pendant un maximum de deux passages jusqu’à ce qu’il y ait un minimum de 5 x 107 cellules.
Tableau 1 : Type de ballon de culture à utiliser en fonction du nombre de cellules triées. On donne des détails sur la taille du ballon de culture pour un nombre approximatif de cellules triées. Le volume de trypsine et le volume de milieu requis pour le type de ballon de culture sont également indiqués.
| Nombre de cellules triées | Type de flacon de culture | Volume de trypsine (mL) | Volume du milieu de culture (mL) |
| De 10 000 à 200 000 | 1 puits d’une assiette à 6 puits ou d’une boîte de Pétri de 3,5 cm | 0,5 | deux |
| De 200 000 à 1 000 000 | 1 fiole de culture T25 | 1 | 4 |
| 1 000 000 > | 1 fiole de culture T75 | deux | 10 |
