1. Dosage MTT pour les cellules leucémiques
- Préparez à l’avance la solution de MTT : Dissoudre 500 mg de MTT formazan dans 10 mL de PBS et agiter (à l’abri de la lumière) avec un agitateur magnétique pendant environ 1 h. Stérilisez la solution avec un filtre de 0,22 μm.
note: La solution peut être conservée dans des aliquotes de 10 mL à −20 °C. Protéger de la lumière directe après décongélation.
- Préparez à l’avance l’isopropanol acidifié : Ajouter 50 mL de HCl 2 M à 2,5 L d’isopropanol.
note: Conservez la solution pendant au moins un mois à température ambiante avant utilisation. Si l’isopropanol n’est pas acidifié correctement, il peut former des précipités avec le milieu et compromettre la lecture spectrophotométrique.
- Préparez une plaque « Jour 0 » (témoin) à fond plat séparée de 96 puits pour assurer une estimation plus précise de l’inhibition de la croissance : consacrez 3 à 6 puits par lignée cellulaire, ajoutez 30 μL de milieu de croissance et 120 μL de suspension cellulaire (8 000 cellules) par puits et 150 μL de milieu de croissance aux puits correspondant aux blancs (pas de cellules). Passez de l’étape 1.9 à l’étape 1.13 de cette section pour mesurer la densité optique (DO).
- Préparez une plaque expérimentale à fond plat de 96 puits : consacrez 30 puits aux concentrations de médicament (10 concentrations, chacune en trois exemplaires), 10 puits aux cellules de contrôle et 10 puits au milieu de contrôle sans cellules (blancs) et préparez une plage de dilution de médicament de la dexaméthasone (Dex) en utilisant le sulfoxyde de diméthyle comme solvant.
note: Pour les cellules CEM-WT, la plage de dilution Dex est comprise entre 2 μM et 0,97 nM. Pour les cellules CEM/R30dm, CEM-R5 et CEM-C3, la plage de dilution Dex est comprise entre 640 μM et 0,33 nM.
- Ajouter 30 μL de chaque dilution Dex dans un puits approprié de la plaque à 96 puits. Assurez-vous d’inclure chaque concentration dans un triple.
- Ajouter 30 μL de milieu de croissance dans les puits correspondant aux cellules témoins et 150 μL de milieu de croissance dans les puits correspondant aux blancs.
- Récoltez les cellules à croissance exponentielle et mettez-les en suspension à leur concentration optimale de semis.
note: Afin de déterminer les concentrations cellulaires de départ optimales, il est recommandé d’évaluer le profil de croissance de chaque lignée cellulaire dans une plaque de 96 puits en ensemencant des cellules à plusieurs concentrations et en le mesurant quotidiennement pendant au moins 4 jours. Choisissez une concentration d’ensemencement qui empêche la prolifération des cellules après 72 h, car cela influencera l’expérience en saturant les valeurs de DO . Pour CEM-WT, CEM-C5 et CEM-R5, la concentration optimale de semis est de 8 000 cellules/puits, tandis que pour CEM/R30dm, elle est de 5 000 cellules/puits.
- Ajouter 120 μL de suspension cellulaire dans chaque puits contenant soit la solution médicamenteuse, soit le milieu de croissance (puits correspondant aux cellules témoins). Remplissez les puits extérieurs vides de la plaque avec 150 μL de PBS pour assurer une bonne humidité dans la plaque et incubez les plaques pendant 72 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture cellulaire.
- Ajouter 15 μL de la solution MTT dans chaque puits et agiter la plaque pendant 5 min avec un agitateur de plaques jusqu’à un maximum de 900 secousses/min.
- Remettez les plaques à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture cellulaire et incubez pendant 4 à 6 h supplémentaires.
- Ajoutez 150 μL d’isopropanol acidifié dans chaque puits et mélangez bien avec une pipette multicanaux pour remettre complètement en suspension tous les cristaux de formazan. Commencez par les puits vides et assurez-vous de bien rincer les pointes avant de passer à une autre rangée de la plaque.
- Incuber la plaque à température ambiante (RT) pendant 10 min.
- À l’aide d’un lecteur de microplaques, déterminez la DO à 540 et 720 nm pour assurer une mesure précise en corrigeant la DO de fond. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier tableur et analysez-le.
2. Analyse des données pour le dosage MTT
- Calculez les valeurs de DO des cellules au « Jour 0 » à l’aide de la formule suivante :
DOJour 0 =Cellules de contrôle DO -Puits blancs DO moyens
- Calculez le pourcentage de cellules survivantes pour chaque concentration de médicament selon la formule suivante :
% de cellules traitées = Moyenne [Cellules traitées en DO -Moyenne des puits blancs en DO - DOJour 0]/[Cellules témoins DO -Moyenne des puits à blanc en DO - DOJour0]*100
- Tracer la courbe dose-réponse (concentration du médicament en fonction de l’inhibition de la croissance en %).
- Calculez la concentration du médicament qui inhibe la croissance des cellules de 50 % (CI50) à l’aide de la courbe dose-réponse.
