Criblage de la mort cellulaire à l’aide de la coloration DAPI : une méthode de dépistage rapide de la mort cellulaire clonogénique induite par l’IR dans des lignées cellulaires cancéreuses

Abstract

Source : Kobayashi, D. et al. Protocole en une étape pour l’évaluation du mode de mort cellulaire clonogénique induite par les rayonnements par microscopie à fluorescence. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente la méthodologie de dépistage des principaux profils de mort cellulaire dans les lignées cellulaires cancéreuses induites par les rayonnements ionisants (IR) à l’aide du test de coloration DAPI. Les noyaux colorés au DAPI des cellules cibles subissant la mort cellulaire présentent des morphologies distinctes et peuvent être facilement identifiés par microscopie à fluorescence.

Protocol

1. Préparation des matériaux

1. Lamelles de recouvrement d’autoclave
   1. Placez les lamelles dans un bécher en verre.
   2. Couvrez le bécher en verre avec du papier d’aluminium.
   3. Autoclave à 121 °C à 15 psi pendant 20 min.
   4. Sécher à 50 °C. Conserver à température ambiante dans une hotte de culture.
2. Préparez la solution de fixation : 3 % de paraformaldéhyde + 2 % de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
   1. Dans une bouteille en verre de 1 000 ml, ajoutez 700 ml de PBS et 30 g de paraformaldéhyde.
      prudence: Le paraformaldéhyde ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Couvercle	Matsunami	C013001
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
saccharose	Sigma-Aldrich	Référence 84097-250G
Saline tamponnée au phosphate	Biographie de Cosmo	Référence 16232000
scalpel	Kai Médical	N° 20, 520-A
Boîte de culture cellulaire de 35 mm	Faucon	353001
Microscope à phase inversée	Shimazu	Référence 114-909
Irradiateur à rayons X	Bioptics de Faxitron	Faxitron RX-650
plat de culture carré	Corning	Référence 431110
Verre de diapositive	Matsunami	Pro-11
Réactif de coloration DAPI	Signalisation cellulaire	LES 8961S
Microscope à fluorescence	Nikon	ÉCLIPSE Ni
microscope à fluorescence filtre DAPI	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
Lentille de microscope à fluorescence (20×)	Nikon	Plan Apo λ 20X/0.75
Lentille de microscope à fluorescence (60×, huile)	Nikon	Huile Plan Apo λ 60X/1.40
huile	Olympe	N5218600
Caméra CCD	Nikon	DS-QI2
logiciel d’acquisition d’images numériques	Nikon	Document NIS-Elements
nettoyant pour lentilles	Olympe	OT0552
chloroforme	Wako	Référence 035-02616