1. Préparation des matériaux
- Lamelles de recouvrement d’autoclave
- Placez les lamelles dans un bécher en verre.
- Couvrez le bécher en verre avec du papier d’aluminium.
- Autoclave à 121 °C à 15 psi pendant 20 min.
- Sécher à 50 °C. Conserver à température ambiante dans une hotte de culture.
- Préparez la solution de fixation : 3 % de paraformaldéhyde + 2 % de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
- Dans une bouteille en verre de 1 000 ml, ajoutez 700 ml de PBS et 30 g de paraformaldéhyde.
prudence: Le paraformaldéhyde est corrosif, porter des gants appropriés.
- Dissoudre complètement le paraformaldéhyde en chauffant à 80 °C à l’aide d’un micro-ondes.
prudence: Les vapeurs de paraformaldéhyde sont toxiques, portez un masque.
- Laisser à température ambiante toute la nuit.
- Ajouter 20 g de saccharose.
- Ajouter PBS pour obtenir un volume total de 1 L.
- Aliquote en tubes de 50 mL. La solution de fixation peut être conservée pendant 3 ans à -20 °C ou pendant 3 mois à 4 °C.
2. Irradiation
ATTENTION : Manipulez l'irradiateur à rayons X avec précaution conformément aux instructions du fabricant.
- Examinez les cellules au microscope en phase inversée. Vérifiez que les cellules sont attachées à la lamelle et vivantes.
- Irradiez la parabole avec des rayons X 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incuber pendant 72 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2.
note: Le temps d’incubation peut être modifié en fonction du plan d’expérience
3. Fixation
- Aspirez les milieux de culture de la boîte.
- À l’aide de ciseaux, coupez l’extrémité d’une pointe de micropipette de 1 000 μL à 5 mm de l’extrémité.
note: La pointe coupée aide à appliquer en douceur la solution de fixation.
- À l’aide de la pointe coupée, ajoutez 1 mL de solution de fixation (préparée à l’étape 1.2) dans le plat à partir de la paroi latérale du plat.
note: Cette étape est urgente et doit donc être effectuée sans changer les pointes des micropipettes lors de la manipulation de plusieurs échantillons. L’application de la solution de fixation directement au fond de la boîte peut endommager les cellules.
- Placez le plat dans un plat de culture carré. Agitez doucement le plat de culture carré pour répartir uniformément la solution de fixation sur la lamelle.
- Incuber 10 min à température ambiante.
- Aspirer la solution de fixation du plat.
- Ajouter 2 ml de PBS dans le plat à partir de la paroi latérale du plat.
note: L’application de PBS directement au fond de la parabole peut endommager les cellules.
- Aspirez le PBS du plat.
- Répétez deux fois les étapes 3.7 et 3.8.
note: Le plat peut être conservé pendant 1 semaine à 4 °C avec les lamelles baignées dans 2 mL de PBS.
4. Coloration DAPI
- Sur une lame de verre, appliquez 5 μL 1 μg/mL de réactif de coloration DAPI.
note: Le réactif de coloration DAPI est stable pendant 6 mois lorsqu’il est stocké à l’abri de la lumière à -20 °C ou moins.
- À l’aide d’un scalpel, retirez la lamelle du plat.
- Prélevez l’excédent de PBS sur la lamelle en touchant le bord de la lamelle avec une serviette en papier.
- Montez la lamelle à l’envers sur la goutte de réactif de coloration DAPI sur la lame de verre afin que les cellules soient exposées au réactif de coloration DAPI.
note: Cette étape est urgente. Le séchage du réactif de coloration DAPI peut entraîner une coloration sous-optimale.
- Les échantillons peuvent être conservés pendant 1 an à -20 °C.
