Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’échafaudage œsophagien décellularisé
- Obtenir des œsophages porcins intacts dans un abattoir à partir de porcs Landrace fraîchement abattus qui sont utilisés pour la production alimentaire. Un seul œsophage fournira suffisamment d’échafaudages pour environ 30 constructions distinctes.
note: En raison du protocole de stérilisation étendu et long requis, il vaut normalement la peine d’obtenir et de traiter un minimum de 10 œsophages à la fois.
- Placez immédiatement l’œsophage fraîchement excisé dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 150 ml de solution de povidone iodée à 10 % pendant 5 minutes pour réduire toute charge microbienne contaminante. Transférez l’œsophage dans un deuxième pot contenant environ 100 ml de PBS stérile contenant 200 UI/ml de pénicilline, 200 μg/ml de streptomycine et 1,25 μg/ml d’amphotéricine B.
- Remettez le couvercle sur le récipient et ramenez l’œsophage au laboratoire à température ambiante. Deux ou trois œsophages peuvent être transportés dans chaque conteneur, en fonction de leur taille.
- Une fois au laboratoire, manipulez le tissu dans une hotte à flux laminaire en utilisant une technique aseptique pour minimiser la contamination microbienne. Stérilisez les pinces à épiler, les ciseaux et les lames de scalpel en les trempant pendant 5 minutes dans de l’éthanol à 70 % et en les rinçant dans du PBS stérile.
- Manipulez l’œsophage à l’aide d’une pince à épiler stérile. À l’aide des ciseaux, ouvrez l’œsophage dans le sens longitudinal. Rincez le tissu en plaçant l’œsophage dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 100 ml de PBS stérile et en agitant doucement pour enlever tous les débris.
- Nettoyez une planche de dissection en liège en vaporisant généreusement de l’éthanol à 70 % et laissez sécher.
- Retirez l’œsophage du PBS et, à l’aide d’aiguilles stériles, épinglez l’œsophage sur la planche, la surface de la muqueuse vers le haut. Saisissez la surface de la muqueuse à une extrémité de l’œsophage à l’aide d’une pince à épiler stérile et retirez-vous de la planche. Cela séparera la muqueuse de la sous-muqueuse sous-jacente.
- Ensuite, utilisez une lame de scalpel stérile pour disséquer l’œsophage longitudinalement le long de la lamina propria, en retirant les broches au fur et à mesure que la dissection progresse pour permettre à la muqueuse d’être soulevée.
- Conservez la muqueuse disséquée et jetez la sous-muqueuse sous-jacente.
- Coupez et jetez les 2 cm les plus proximaux et distaux de la muqueuse car il y a un plus grand nombre de glandes sous-muqueuses et une lamina propria plus épaisse dans ces zones, respectivement.
- À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu restant en 5cm2. Placez tous les tissus coupés dans un pot stérile de 180 ml contenant environ 150 ml de PBS stérile et agitez doucement pour rincer les tissus. Si vous traitez plus de cinq œsophages à la fois, il peut être nécessaire d’utiliser plusieurs pots pour cette étape et les trois suivantes.
- À l’aide d’une pince à épiler stérile, transvaser le tissu coupé dans un pot de 180 ml contenant 150 ml de 1 M de NaCl stérile, 200 UI/ml de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine et 1,25 μg/mL d’amphotéricine B. Incuber pendant 72 h à 37 °C.
- Placez le mouchoir dans un pot frais de 180 ml contenant 150 ml de PBS stérile. L’épithélium aura commencé à se séparer visiblement du tissu sous-jacent. Pelez délicatement l’épithélium qui se détache de l’œsophage du porc à l’aide d’une pince stérile et jetez-le.
- Placez le reste du tissu dans une casserole fraîche de 180 ml et ajoutez 150 ml de PBS stérile. Agitez doucement pendant 5 min pour laver. Videz le PBS et répétez l’opération deux fois avec du PBS frais.
- Placez tout le tissu dans une bouteille en verre de 500 ml contenant 400 ml de solution stérile de glycérol à 80 % (v/v) pendant 24 h à température ambiante. Transférer dans 400 mL de solution stérile de glycérol à 90 % (v/v) pendant 24 heures supplémentaires.
- Conserver dans 400 mL de solution stérile de glycérol à 100 % à température ambiante pendant au moins 4 mois pour déshydrater et stériliser le tissu tout en préservant l’intégrité de la membrane basale.
