Extraction d’exosomes à base de billes magnétiques : une technique pour isoler des exosomes spécifiques à partir de biofluides

Résumé

Source : Tu, M. et al. Détection de biomarqueurs exosomaux par libération et mesure induites par champ électrique (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure permettant d’isoler des exosomes de biofluides cibles à l’aide de microbilles magnétiques. La procédure permet de capturer rapidement des exosomes, qui peuvent être utilisés pour l’analyse en aval.

Protocole

1. Extraction d’exosomes à base de billes magnétiques

1. Pipetez une solution bien mélangée de 5 μL de microparticules magnétiques enrobées de streptavidine dans 495 μL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS) dans un tube de microcentrifugation pour remettre les billes en suspension. Lavez et remettez en suspension les billes avec 500 μL de PBS trois fois à l’aide d’une grille magnétique. Le rack est un ensemble d’aimants sur le côté d’une unité de logement qui peut contenir les tubes de microcentrifugation d’échantillons.
   1. Pour chaque lavage, laissez d’abord les tubes reposer sur le support pendant 1 minute, puis utilisez une pointe de pipette pour retirer soigneusement le tampon surnageant sans déranger les billes.
   2. Placez les tubes sur une grille régulière sans aimants sur le côté. Ajoutez 500 μL de PBS dans les tubes et utilisez la pipette pour mélanger la solution et les billes. Ensuite, remettez les tubes sur le support magnétique pour séparer à nouveau les billes de la solution.
   3. Effectuez cette élimination du tampon par magnétisation et remise en suspension dans PBS au total trois fois. Celui-ci effectue un premier lavage des particules magnétiques.
2. Remettez les billes en suspension dans 490 μL de tampon PBS, avec le tube placé sur la partie non aimantée du rack magnétique. Pipeter 5 μL d’anticorps anti-CD63 humains de souris biotinylés à une concentration de 1,0 mg/mL dans le mélange de billes. À l’aide de la pipette, mélangez les billes et l’anticorps dans la solution.
3. Placez les tubes de microcentrifugation avec une bille et un mélange d’anticorps biotinylés sur un rotateur d’échantillon. Réglez les paramètres du rotateur d’échantillon pour une rotation inverse à 90°, une inclinaison pendant 5 s et une vibration à 5° pendant 1 s. Faites pivoter les tubes de mélange échantillon-billes à ces paramètres pendant 30 min à RT.
4. Retirer l’anticorps non lié après la conjugaison.
   1. Après 30 min de rotation à RT, replacez les tubes dans le rack magnétique pendant 5 min.
   2. Effectuez trois lavages de billes en retirant la phase liquide à l’aide d’une micropipette et lavez avec 500 μL de PBS. Après le triple lavage, remettez les billes en suspension dans 490 μL de caséine-PBS et placez-les sur la partie non magnétisée du rack.
5. Extraction d’exosomes à l’aide de billes enrobées d’anticorps.
   1. Étiquetez chaque tube avec l’ID de l’échantillon ciblé. Pipetez un échantillon de 10 μL de sérum ou de salive dans le tube de microcentrifugation. À l’aide de la pipette, mélangez l’échantillon et les billes magnétiques en pipetant plusieurs fois.
   2. Placez les tubes contenant l’échantillon et les billes d’anticorps CD63 humains sur le rotateur et tournez-les pendant 2 h à RT. Utilisez les mêmes paramètres de rotateur que ceux décrits à l’étape 1.3.
   3. Après 2 h de rotation de l’échantillon, effectuer un triple lavage par magnétisation pour séparer les billes de la solution, en éliminant la phase liquide à l’aide d’une micropipette et en remettant les billes en suspension dans 500 μL de tampon Tris-HCl. Les billes résultantes sont maintenant liées aux exosomes et sont prêtes pour la libération et la mesure du champ électrique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps CD63 humain biotinylé	Ancell, États-Unis	Référence 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, États-Unis	Référence 65601
Aimant néodyne (1/10 » de diamètre x 1/32 » d’épaisseur)	K&J Magnetics, États-Unis	DH101
Eau distillée ultra-pure	Life Technologies, États-Unis	Référence 10977-023
Anti-Fluorescéine-POD, Fragments Fab	Roche, Allemagne	11426346910
Solution saline tamponnée au phosphate	Life Technologies, États-Unis	10010023
Caséine/PBS	Fisher Scientific, États-Unis	Référence 37532