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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Digestion des tissus
- À l’aide d’une plaque de culture tissulaire de 100 mm, hacher mécaniquement le tissu en petits morceaux de ~1 à 2 mm à l’aide de ciseaux de dissection stérilisés en autoclave et d’une pince chirurgicale (figures 1B, C). Le tissu conjonctif entre les morceaux doit être coupé pour assurer une bonne séparation et faciliter les étapes suivantes.
- Ajouter 6 ml de la solution de dispase/collagénase au tissu haché. Incuber ensuite à 37°C pendant environ 30 min à 1 h.
- Perturbez le tissu en pipetant 15 à 20 fois avec une pipette sérologique de 5 ml.
- Incuber à 37°C pendant encore 30 min à 1 h.
- Répétez les étapes 1.3 et 1.4 deux ou trois fois de plus ou jusqu’à ce que le tissu ressemble à une bouillie et puisse facilement passer à travers l’ouverture de la pipette (Figure 1D).
note: La taille de départ de l’échantillon de tissu et la finesse du hachage du tissu détermineront le nombre de fois qu’il faut répéter les étapes 1.3 et 1.4. En règle générale, nous recevons des tissus d’environ 1 cm x 1 cm. De plus, on peut surveiller la dissociation des tissus à l’aide d’un microscope de culture tissulaire inversée standard pour suivre la progression de la dissociation cellulaire du tissu. De petits amas de cellules sont idéaux pour la croissance initiale des cellules salivaires sous forme de salisphères.
2. Revêtement des puits avec une matrice de membrane basale
REMARQUE : La matrice de membrane basale (BMM) doit être décongelée pendant la nuit à 4°C la veille de son utilisation. Une fois décongelé, le BMM doit être constamment maintenu sur de la glace ou à 4 °C, car il se solidifie rapidement (c.-à-d. forme un gel) à des températures plus chaudes. De plus, des précautions doivent être prises si les échantillons ont été refroidis sur de la glace avant d’être plaqués sur le BMM, car les échantillons froids feront « fondre » le BMM et exposeront les cellules à la boîte en plastique.
- Pipetez lentement BMM (voir la table des matériaux) dans chaque puits à revêtir. Répartissez uniformément et lentement le BMM sur le well.
REMARQUE : Généralement, nous utilisons 500 μL par puits d’une plaque à 6 puits, mais ce volume peut être ajusté pour une utilisation sur d’autres variantes de plaques, telles que 12 puits ou 24 puits, ou à volonté pour des hydrogels plus épais ou plus minces.
- Incuber les plaques revêtues à 37 °C pendant au moins 15 minutes avant de les utiliser pour laisser le temps au BMM de se solidifier.
3. Filtrage des tissus non digérés, lyse des globules rouges et placage cellulaire
- Transvaser l’homogénat de tissu de l’étape 1.5 dans un tube conique de 15 mL. Lavez une fois la plaque avec 6 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco pour transférer les cellules restantes.
- Filtrer l’homogénat dans un tube conique de 50 mL à travers une crépine à cellules en nylon de 70 μm pour éliminer les tissus non digérés. Centrifugeuse : cellules contraintes pendant 5 min à 500 x g.
- Diluer 10x tampon de lyse des globules rouges dans du dH2O stérile pour obtenir une solution de travail 1x.
- Aspirez le surnageant. Ensuite, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de 1 tampon de lyse GR. Incuber 5 min à 37°C.
- Ajouter 20 à 25 ml de DPBS pour neutraliser le tampon de lyse des globules rouges et minimiser la lyse des cellules salivaires. Centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g.
note: Après le traitement avec un tampon de lyse des globules rouges, la pastille cellulaire doit être blanche. La couleur rouge de la pastille indique que tous les globules rouges n’ont pas été complètement lysés. Répétez les étapes 3.4 à 3.5 si nécessaire pour une lyse complète de tous les globules rouges.
- Aspirez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 1 à 2 mL de BEGM par puits, puis placez les cellules remises en suspension sur des puits recouverts de BMM. Incuber à 37°C.
- Une fois plaquées sur BMM, les cellules se formeront en structures sphériques ou « salisphères » sur une période de 2 à 3 jours. Les cellules peuvent être maintenues sous forme de salisphères pendant environ 5 à 7 jours avant que le BMM ne commence à se dégrader, ce qui permet aux cellules d’accéder et d’adhérer au plastique et de se développer en monocouche.