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1. Préparation des sondes de nanoparticules
REMARQUE : Ce test utilise des nanotiges d’or fonctionnalisées (AuNR ; 25 nm de diamètre x 71 nm de longueur) qui sont conjuguées de manière covalente avec des polymères de neutravidines (AV) et ont un pic de résonance plasmonique de surface qui produit un signal de diffusion rouge (pic de 641 nm) lors de l’éclairage DFM.
- Laver 40 μL d’AuNR-AV (2,56 x 1011 particules) trois fois avec 200 μL de PBS (pH 7,0) par centrifugation et aspiration (8 500 x g à 4 °C pendant 10 minutes), suivie d’une dernière étape de centrifugation et d’aspiration, après quoi la pastille d’AuNR-AV est suspendue dans 40 μL de PBS.
- Mélangez cette suspension AuNR-AV avec 10 μL d’anticorps biotinylés (0,5 mg/mL) spécifiques d’un antigène à la surface du sous-type d’exosome d’intérêt et 150 μL de PBS, puis mélangez à 4 °C pendant 2 h à l’aide d’un mélangeur pour permettre à la liaison neutravidine-biotine d’atteindre son achèvement.
- Laver les AuNR conjugués aux anticorps (AuNR-IgG) résultants trois fois par centrifugation et aspiration (6 500 x g à 4 °C pendant 10 minutes), puis les suspendre dans 200 μL de PBS et les stocker à 4 °C jusqu’à utilisation.
note: Une technique stérile et des durées de stockage courtes doivent être utilisées pour éviter la contamination et la dégradation des AuNR-IgG. Il est préférable d’utiliser les AuNR conjugués aux anticorps dans les 24 heures suivant leur conjugaison.
2. Préparation des diapositives de capture EV
- Diluer les anticorps de capture d’exosomes sélectionnés à 0,025 mg/mL dans du PBS et ajouter 1 μL/puits de cette dilution sur une lame de protéine A/G multi-puits, puis incuber cette lame à 37 °C pendant 1 h dans une chambre humidifiée pour permettre la liaison des anticorps de capture à la protéine A/G immobilisée sur la lame.
- Aspirer les puits pour éliminer les anticorps non liés et les laver trois fois par l’ajout et l’aspiration de 1 μL/puits de PBS. Ensuite, chargez chaque puits avec 1 μL de tampon de blocage (voir le tableau des matériaux) et incubez la lame pendant 2 h à 37 °C dans une chambre humidifiée pour bloquer les sites de liaison aux protéines restants.
- Aspirez les puits pour éliminer le tampon bloquant, lavez les puits trois fois par l’ajout et l’aspiration de 1 μL/puits de PBS, et utilisez immédiatement les lames bloquées pour la capture et l’analyse des exosomes.
3. Préparation de la courbe standard
- Pour quantifier avec précision l’abondance absolue ou relative d’un sous-type d’exosome spécifique, l’utilisateur doit générer une courbe standard avec une population d’exosomes purs qui exprime uniformément le biomarqueur de surface de l’exosome d’intérêt. Cette étude analyse l’abondance d’exosomes exprimant une protéine membranaire associée aux métastases, le récepteur de l’éphrine A2, qui a une relation rapportée avec le stade et le pronostic du cancer du pancréas.
note: La lignée cellulaire du cancer du pancréas humain PANC-1 et ses exosomes sont connus pour exprimer cette protéine et des exosomes isolés de cette lignée cellulaire ont été utilisés pour générer une courbe standard afin de quantifier le nombre d’exosomes qui expriment cette protéine dans des échantillons d’exosomes complexes.
- Cultiver des cellules pendant 48 heures à 37 °C dans des milieux de culture sans sérum pour permettre l’accumulation d’exosomes dans le milieu, puis isoler les surnageants de culture cellulaire par centrifugation de cultures en suspension ou aspiration directe de milieux de culture à partir de cultures cellulaires adhérentes.
- Centrifuger le milieu collecté à 2000 x g pendant 30 min pour éliminer les débris et récupérer le surnageant.
- Filtrer le surnageant de culture clarifié à l’aide d’une unité de filtration à faible liaison protéique de 0,45 μm de capacité appropriée (p. ex., une unité de filtration sous vide de polyéther sulfone de 250 mL).
- Concentrer le filtrat obtenu par centrifugation à 3200 x g à l’aide d’un système de filtration de limite de poids moléculaire nominal de 100 000 jusqu’à un volume final de 250 μL. Récupérez le volume retenu de ce filtre, puis lavez-le avec 200 μL de PBS et combinez ce volume de lavage avec le volume de l’échantillon d’exosome collecté.
- Centrifugez cet échantillon à 21 000 x g pendant 45 minutes et récupérez soigneusement le surnageant, en prenant soin de ne pas prélever de matière précipitée.
- Centrifuger le surnageant récupéré à 100 000 x g pendant 3 heures pour précipiter les exosomes. Aspirez le surnageant et recueillez la pastille d’exosome dans 100 μL de PBS.
- Stocker les suspensions d’exosomes résultantes à 4 °C si elles sont utilisées dans les 24 heures ou à -80 °C pour un stockage à long terme.
REMARQUE : Ne soumettez pas les échantillons d’exosomes à des cycles de gel-dégel répétés.
- Quantifier une aliquote de la suspension d’exosomes après mélange en mesurant directement le nombre d’exosomes (p. ex., par analyse de suivi des nanoparticules ou détection d’impulsions résistives accordables ou en mesurant la concentration protéique des lysats d’exosomes par dosage de l’acide micro-bicinchoninique, ou une méthode équivalente, comme moyen d’estimer la quantité d’exosomes).
- Générer un ensemble de dilutions en série de la suspension d’exosomes pour permettre la comparaison du signal des nanoparticules avec le nombre d’exosomes d’entrée ou le contenu en protéines.
- Transférez 1 μL de chaque étalon d’exosome dans chacun de ses puits répliqués sur la plaque d’essai.
REMARQUE : Des courbes standard peuvent être utilisées pour calculer la pente de la ligne de corrélation entre le signal des nanoparticules et la concentration d’exosomes afin (1) d’évaluer les performances du test et (2) de déterminer la concentration relative des exosomes cibles dans les échantillons expérimentaux.
4. Traitement d’échantillons de plasma ou de sérum humain
- Prélever des échantillons de plasma ou de sérum selon des méthodes standard et les conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour l’analyse des exosomes. Décongeler rapidement les échantillons dans un bain-marie à température ambiante. Mélanger à plusieurs reprises les échantillons décongelés par inversion pour favoriser une suspension homogène.
REMARQUE : Les résultats des échantillons de sérum et de plasma peuvent ne pas être équivalents car il y a une libération importante d’exosomes pendant la réaction de coagulation.
- Centrifuger des échantillons de plasma ou de sérum à 500 x g pendant 15 minutes pour précipiter les agrégats de protéines et autres débris. Transférez une aliquote de l’échantillon de plasma ou de sérum dans un tube frais et ajoutez du PBS pour générer une dilution de 1:1. Mélanger l’échantillon dilué par vortex doux ou inversion, selon le cas. Transférez 1 μL de chaque suspension de plasma ou de sérum dans chacun de ses puits de réplication sur la plaque de dosage.
5. Capture et détection d’exosomes
- Chargez les puits d’une lame de capture EV bloquée avec 1 μL/puits d’échantillon d’exosome, en utilisant 8 répétitions par échantillon, et incubez la lame pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Aspirez tous les puits d’échantillonnage, puis ajoutez 1 μL/puits de PBS dans les puits de lavage et éliminez les exosomes non liés et autres contaminants de l’échantillon d’exosome chargé.
- Chargez les puits d’échantillonnage avec 1 μL/puits d’une suspension AuNR-IgG préalablement préparée (voir section 1 ci-dessus) et incubez la lame pendant 2 h à 37 °C dans une chambre humidifiée. Aspirez la solution de nanoparticules et lavez la lame dans du PBS complété par 0,01 % de Tween-20 (PBST) pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur, puis aspirez et lavez tous les puits d’échantillon avec de l’eau désionisée pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur rotatif et séchez-les à l’air pour obtenir des images LMDFM ultérieures.
REMARQUE : Les coefficients de variation (CV) entre les essais sont évalués à partir de huit répétitions du même échantillon. Les échantillons qui présentent des CV >20 % sont considérés comme non informatifs et doivent être répétés s’il y a suffisamment d’échantillons.