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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des CTC
- Calculer le nombre de CTC nécessaires pour l’injection et préparer une suspension unicellulaire à 1,0 × 104 cellules/μL dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Placez la suspension cellulaire sur de la glace ou à 4 °C tout au long de la procédure.
note: Lorsque vous utilisez des lignées cellulaires qui nécessitent une trypsinisation, assurez-vous de laver les cellules deux fois avec du PBS stérile pour éliminer la trypsine. Effectuez la numération cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Si une grande cohorte (>50 souris) est utilisée, recompter les cellules et valider la viabilité cellulaire entre les injections pour s’assurer qu’un nombre constant de cellules est administré par souris.
2. Procédure préchirurgicale
- Injecter à la souris par voie sous-cutanée 5 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée (Bup-SR).
note: Ne pas injecter la zone de l’incision proposée ; Choisissez un site d’injection bien éloigné de l’omoplate.
- Anesthésie la souris avec de l’isoflurane à 2 à 3 % jusqu’à ce qu’elle ne montre aucun signe de réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et/ou de la patte pour confirmer l’état de l’anesthésie.
- Préparez la souris pour l’opération dans un endroit éloigné de la zone d’opération. Coupez le site chirurgical (c’est-à-dire la surface dorsale du crâne) avec une zone de bordure suffisante pour empêcher la fourrure de contaminer le site d’incision ; Ensuite, saturez le site avec un antiseptique cutané germicide, en travaillant du centre du site vers la périphérie, puis laissez sécher. Appliquez soit un champ stérile, soit un matériau de champ en plastique adhésif stérile pour protéger le site chirurgical de la contamination.
note: Les instruments doivent être autoclavés à l’avance et les pointes doivent être restérilisées entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre.
- Rasez la fourrure de toute la surface ventrale de la tête et préparez la peau à l’aide de la technique stérile.
- Situez le nez à l’aide d’un cône nasal en forme de L modifié de l’appareil stéréotaxique, en veillant à ce que les narines restent claires et ouvertes. À l’aide de ruban adhésif sur les surfaces ventrales des deux pavillons, tirez doucement la peau vers l’avant pour la fixer au cône nasal et pliez le cou à un angle d’environ 90° une fois fixé. Administrer 1,5 % d’isoflurane pour maintenir l’anesthésie.
note: Un bon positionnement permettra de présenter la zone d’incision de manière à permettre l’identification facile de la crête caudale de l’os occipital.
- Positionnez le corps pour vous assurer que la colonne vertébrale est maintenue au niveau de la citerne magna, et tout en appliquant une légère traction sur la queue, placez du ruban adhésif à la base de la queue pour la fixer.
3. Injection chirurgicale de citerne magna
- Avec le cou en pleine extension, et en commençant juste entre les pavillons, passez les pointes des ciseaux chirurgicaux vers le bas avec une légère pression sur l’os occipital.
note: Dans cette position médiane, une petite dépression est perceptible lorsque les pointes des ciseaux plongent dans la zone concave au-dessus de la citerne magna.
- Faites une petite incision médiane de 3 à 5 mm juste au-dessus de la concavité palpée. Prélever 5 μL de suspension cellulaire à 1,0 × 104 cellules/μL (total 5,0 × 104 cellules) dans une seringue Hamilton de 30 G.
- À l’aide d’une pince à bout émoussé avec des pointes de 1 à 2 mm, appuyez doucement sur la citerne magna. Introduisez les pointes en position fermée et ouvrez-les tout en appliquant une pression vers le bas sur la dure-mère.
- Répétez la dissection contondante décrite à l’étape précédente jusqu’à ce que la membrane durale soit facilement identifiée et que les vaisseaux sanguins associés soient visibles dans la zone exposée.
note: La fenêtre d’injection qui en résulte garantit que les vaisseaux sanguins ne sont pas endommagés lors de l’insertion de l’aiguille.
- Tout en maintenant la pince ouverte pour rétracter la musculature environnante, introduisez une aiguille non carottante de 30 G sous la dure-mère pour visualiser le biseau. Assurez-vous que l’aiguille n’est introduite que juste au-delà du biseau lui-même. Déployez lentement un piston de seringue et déposez les cellules juste en dessous de la dure-mère.
- Placez correctement le biseau pour observer l’injection sous la dure-mère. Administrez soigneusement la technique et utilisez l’aiguille non carottante de 30 G pour éviter d’endommager la membrane et assurer une fuite minimale. Si une fuite est remarquée, appliquez une légère pression avec un applicateur à embout de coton.
- Fermez la peau en appliquant une pince à plaie ou une micro-goutte d’adhésif pour la peau. Une fois l’injection réussie, laissez les souris se remettre de l’anesthésie sur une couverture chaude, en les observant continuellement jusqu’à ce qu’elles puissent maintenir la position sternale et démontrer un mouvement ciblé.
- Surveillez les souris tous les jours après la chirurgie pendant la première semaine. Si une souris semble souffrir ou être en détresse, traitez-la avec une injection sous-cutanée de 10 mg/kg de carprofène une fois toutes les 12 à 24 heures pendant un maximum de 5 jours, selon la consultation et les directives du vétérinaire. Laissez les souris récupérer et surveillez-les pendant au moins 48 à 72 h avant de passer à l’étape suivante.
note: Bup-SR, administré de manière préventive, durera jusqu’à 72 h, de sorte que des analgésiques supplémentaires ne sont normalement pas nécessaires. Cependant, les animaux recevront des analgésiques supplémentaires si nécessaire (s’ils sont léthargiques, ne mangent pas, ébouriffés). Si un site chirurgical développe des signes d’infection postopératoire (c’est-à-dire une rougeur, un gonflement, une sensibilité, une allodynie, une hyperalgésie, une hyperpathie ou une suppuration), ou si la souris garde la zone affectée, euthanasiez la souris. Si les cellules cancéreuses sont injectées avec succès dans le LCR, la LMD et la progression tumorale se développeront dans le SNC en 1 ou 2 semaines (selon les types de CTC ou de lignées cellulaires utilisés) (Figure 1).
