Injection intra-ventriculaire chez la souris : une méthode d’administration directe de médicaments médiée par Ommaya pour administrer des médicaments aux ventricules cérébraux du cerveau de souris

Résumé

Source : Law, V. et al. A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre l’injection intra-ventriculaire médiée par l’ommaya dans un modèle murin. La méthode permet l’administration localisée de candidats médicaments potentiels et échappe à la barrière hémato-encéphalique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Assemblage et implantation d’Ommaya murin

1. Préparation de la station
   1. Désinfectez la surface de la station. Placez un revêtement bleu sur la surface et gardez à portée de main tous les outils et fournitures stérilisés indiqués à la figure 1.
2. Procédure préchirurgicale
   1. Appliquer l’analgésie (Bup-SR) et maintenir un environnement chirurgical stérile.
3. Implantation chirurgicale de Murine Ommaya
   1. Assemblez le dispositif d’injection Murine Ommaya à l’aide d’un orifice d’injection miniature de 25 G (diamètre extérieur de 0,51 mm) et d’un disque d’espacement de 1 mm. Utilisez un adhésif stérile cyanoacrylate pour assurer la pénétration d’environ 2,5 mm de la canule métallique dans l’hémisphère cérébral droit (figures 2A à C).
      note: Un prototype de souris Ommaya compatible avec l’IRM a été développé dans ce laboratoire, dont les deux pièces (port d’injection miniature et entretoise) ont déjà été imprimées en 3D comme une seule unité (Figure 2D). La version monobloc a été testée par MRI et permet de gagner du temps en éliminant l’étape d’assemblage.
   2. Anesthésez la souris avec de l’isoflurane à 2 à 3 % jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signes de réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et/ou de la patte pour confirmer l’état de l’anesthésie.
   3. Rasez toute la surface ventrale de la tête de la fourrure et préparez la peau selon la technique stérile. Placez la souris dans l’appareil stéréotaxique avec un cône nasal pour continuer l’administration d’isoflurane pendant la procédure ; Réduire la dose d’isoflurane à 1,5 %. Serrez doucement les barres d’oreille pour fixer la tête et appliquez un lubrifiant pour les yeux pour couvrir les yeux de la souris.
   4. Faites une petite incision cutanée (3 mm), suivie d’une dissection émoussée des tissus sous-cutanés sous-jacents pour exposer le crâne. Séchez le crâne à l’aide de bâtonnets applicateurs à embout de coton imbibés de peroxyde d’hydrogène.
   5. Percez un trou de bavure dans le crâne à 0,5 mm en arrière et à 1,1 mm sur le côté latéral du bregma, le point anatomique du crâne où la suture coronale est coupée perpendiculairement par la suture sagittale (Figure 2A), ainsi qu’un trou de bavure de 0,9 mm pour exposer la dure-mère. Écartez le micro-foret et entaillez doucement l’os entourant immédiatement le trou de la fraise avant d’insérer un orifice d’injection (profondeur d’environ 2,5 mm), fixé au crâne à l’aide d’un adhésif stérile cyanoacrylate. Énoncez la suture autour du point d’injection à l’aide de sutures en nylon 4-0 sans absorption dans un motif de point interrompu ou une suture de cordon de bourse.
   6. Hébergez des souris post-opératoires dans des cages individuelles pour la récupération chirurgicale.
      note: Il est possible que l’Ommaya murin se détache lorsque plusieurs souris récupérées d’une intervention chirurgicale sont logées dans la même cage, peut-être en raison d’interactions constantes d’altération. Il est recommandé que les souris implantées dans Murine Ommaya soient logées individuellement (ou pas plus de 2 souris par cage) au cours de l’essai d’efficacité du médicament.

2. Traitement de l’Ommaya murin

1. Dosage de souris à l’aide de l’Ommaya murin
   1. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane à 2 à 3 %, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signes de réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et/ou de la patte pour confirmer le maintien de l’anesthésie.
   2. Accédez à Murine Ommaya à l’aide d’un adaptateur d’injection et d’une seringue Hamilton. À l'aide d'une pince, tenez le haut de l'orifice d'injection miniature et insérez doucement l'adaptateur d'injecteur d'orifice complètement dans le septum de l'orifice.
      note: L’injecteur d’orifice perce le septum de l’orifice de manière à réduire l’espace mort au minimum et permet une injection contrôlée au moyen d’une pousse-seringue motorisée (figure 3A). Les traitements ciblés/nouveaux sont injectés à un débit de 1 μL/min sous anesthésie. Le traitement doit être administré à des intervalles déterminés (quotidien/hebdomadaire) pour une durée déterminée (semaines/mois), à la discrétion du chercheur.
      Un volume compris entre 3 et 7 μL est optimal, car un volume <3 μL n’est pas fiable et un volume >7 μL peut entraîner une pression trop élevée. La taille de la seringue Hamilton peut varier de 10 à 100 μL, selon le nombre de souris dans chaque bras de traitement. Le préchargement du volume approprié dans la seringue Hamilton empêchera le remplacement répété de la seringue, minimisant ainsi les erreurs. Il est préférable de consacrer 1 seringue Hamilton par bras de traitement.
   3. Une fois l’injection faite, détachez la souris Ommaya de l’adaptateur d’injection à l’aide d’une pince et remettez la souris dans la cage pour récupérer de l’anesthésie.

Résultats

Figure 1 : Exemple de configuration d’un poste de travail pour effectuer l’implantation de Murine Ommaya chez la souris. (1) Appareil d’anesthésie gazeuse/vaporisateur. (2) Rideau de papier bleu stérile recouvrant un support stéréotaxique. (3) Dispositif stéréotaxique (support/scène, barres d’oreille, cône nasal). (4) Micro-foreteuse. (5) Loupe avec lumière. (6) Bâtonnets applicateurs stériles à embout de coton avec récipient de rinçage salin sté...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disque d’espacement de 1 mm	Alzet, société Durect	#0008670	Disque d’espacement uniquement
Suture en nylon éthylon 4-0	N’importe quel fournisseur
Pousse-seringues automatiques	Pompes à seringue Harvard (ou tout autre fournisseur)	Réf. #70-4505	Pompe 11 Elite
Stérilisateur à billes	Braintree Scientific Inc. (ou tout autre fournisseur)	#GER 5287-120V	Germinateur 500
Buprénorphine à libération prolongée (Bup-SR)	Zoopharm		Contrôlé par la DEA
Adhésif stérile cyanoacrylate	N’importe quel fournisseur
Système d’anesthésie par inhalation de gaz	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Seringues de microlitre Hamilton	Hamilton		10, 25, 50 et 100 μL ; 30G pour l’injection de citerne magna
Peroxyde d’hydrogène	N’importe quel fournisseur
Système d’imagerie IVIS 200	Pied à coulisse Sciences de la vie
Loupe avec lumière	N’importe quel fournisseur
Micro-perceuse	Stoelting (ou tout autre fournisseur)	#51555M
Imagerie IRM	Bruker	Série BioSpec	optionnel
Prototype murin Ommaya (compatible avec l’IRM)	Laboratoires Instech, Inc.	#VAB620-25IRM3.3
Injecteur PinPort	Laboratoires Instech, Inc.	#PNP3M-50
PinPort	Laboratoires Instech, Inc.	#1-PNP3F28-50
Instruments chirurgicaux pour rongeurs (ciseaux, pinces)	Roboz Surgical Instrument (ou tout autre fournisseur)
Dispositif stéréotaxique	Stoelting (ou tout autre fournisseur)	#51730M
Papier bleu stérile / revêtement de champ	N’importe quel fournisseur
Bâtonnets de coton stériles	N’importe quel fournisseur